一种双酶偶联合成高浓度(S)-构型玻色因的方法技术

本发明专利技术公开了一种双酶偶联催化合成(S)

【技术实现步骤摘要】
一种双酶偶联合成高浓度(S)
‑
构型玻色因的方法
(一)

[0001]本专利技术属于生物催化领域，涉及一种以β
‑
丙酮木糖苷为底物双酶偶联催化合成高浓度(S)
‑
构型玻色因的方法。
(二)
技术介绍

[0002]玻色因，化学名为羟丙基四氢吡喃三醇，分子式C8H
18
O5，分子量为192.21，具有良好的抗衰活性。它可以增加细胞及皮肤的紧致度，还可以帮助维持真皮的弹性，预防皮肤老化。此外，玻色因易于生物降解，不会在生物体内积累，没有毒性，在生物、医药、化妆品等领域的应用日渐宽广。玻色因是一种木糖衍生物，它有多种立体异构体，不同的异构体特征对生物活性具有影响。研究论文(Synthesis of Pro
‑
Xylane
TM
:A new biologically active C
‑
glycoside in aqueous media)中提到β
‑
糖苷键对维持玻色因生物活性的重要性远大于α
‑
糖苷键，而羟丙基四氢吡喃三醇的7位手性碳原子上的(S)
‑
羟基为优势构型，即兼具β
‑
糖苷键和(7S)
‑
羟基的(S)
‑
构型玻色因生物活性更好。
[0003]玻色因的合成以木糖为原料，在碱性条件下与2,4
‑
戊二酮缩合反应生成β
‑
丙酮木糖苷，β
‑/>丙酮木糖苷的羰基经还原反应生成玻色因。β
‑
丙酮木糖苷的羰基还原合成(S)
‑
构型玻色因，因需要引入手性羟基，是合成(S)
‑
构型玻色因的关键步骤。相较于化学法，生物酶法合成(S)
‑
构型玻色因更加安全高效，成本低廉，立体选择性专一且对环境更加友好。尽管生物酶法具有诸多优点，目前适用的底物浓度不高于50g/L，生物酶法合成高浓度(S)
‑
构型玻色因的方法尚有待开发。
(三)
技术实现思路

[0004]本专利技术目的是提供一种双酶偶联催化β
‑
丙酮木糖苷还原合成高浓度(S)
‑
构型玻色因的方法，以β
‑
丙酮木糖苷为底物、以异丙醇为辅底物、优选的源自Lentilactobacillus kefiri的短链醇脱氢酶LkCR为生物催化剂，辅酶循环体系由醇脱氢酶和异丙醇组成。生物催化剂利用还原型辅酶(NADH或NADPH)催化β
‑
丙酮木糖苷选择性加氢生成(S)
‑
羟丙基四氢吡喃三醇和氧化型辅酶(NAD
+
或NADP
+
)，而优选的醇脱氢酶和异丙醇则起到驱动辅酶循环的作用，将氧化型辅酶转换为还原型辅酶。该生物催化体系可适用1000mM底物β
‑
丙酮木糖苷(190g/L)，产物非对映体选择性>99％。该方法具有催化效率高、适用底物浓度高和产物易于分离纯化等优点，后续的产物分离纯化过程简便。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]本专利技术提供一种双酶偶联催化合成高浓度(S)
‑
构型玻色因的方法，所述方法为：以含源自Lentilactobacillus kefiri的短链醇脱氢酶LkCR编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的粗酶液作为催化剂，以β
‑
丙酮木糖苷为底物，以NAD
+
或NADP
+
为辅酶，加入辅助催化剂和辅底物驱动辅酶循环，以pH 5.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度为25～45℃，300～600rpm条件下反应完全后，反应液分离纯化，获得(S)
‑
羟丙基四氢吡喃三醇，即(S)
‑
构型玻色因。该催化体系可适用1000mM底物β
‑
丙酮木
糖苷(190g/L)，转化率>99％。本专利技术反应过程中利用自动滴定系统维持pH恒定，滴定所用的碱液为1M NaOH水溶液。所述辅助催化剂包括含葡萄糖脱氢酶BmGDH、甲酸脱氢酶AaFDH或是醇脱氢酶RaADH的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎获得的粗酶液。所述辅底物包括葡萄糖、甲酸铵、异丙醇。
[0007]进一步，所述短链醇脱氢酶LkCR是将LkCR编码基因导入大肠杆菌构建获得的基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经破碎后获得的粗酶液。所述短链醇脱氢酶LkCR编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。短链醇脱氢酶LkCR基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.1所示LkCR编码基因插入pET28a载体的Nde I和Hind III限制性酶切位点，得到重组载体pET28a
‑
LkCR；将重组载体pET28a
‑
LkCR导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
LkCR。
[0008]进一步，所述辅助催化剂分别通过将编码基因导入大肠杆菌构建获得基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体经破碎后获得的粗酶液。所述葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所述，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。所述甲酸脱氢酶AaFDH编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。所述醇脱氢酶RaADH编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。葡萄糖脱氢酶BmGDH基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.3所示葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因插入pET28a载体的BamH I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pET28a
‑
BmGDH；将重组载体pET28a
‑
GDH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
BmGDH。甲酸脱氢酶AaFDH基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.5所示甲酸脱氢酶AaFDH编码基因插入pET28a载体的BamH I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pET28a
‑
AaFDH；将重组载体pET28a
‑
AaFDH导入宿主细胞E.coli BL21(DE3)，得到重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28a
‑
AaFDH。醇脱氢酶基因工程菌构建方法为：将SEQ ID NO.7所示醇脱氢酶RaADH编码基因插入pET28a载体的BamH I和Xho I限制性酶切位点，得到重组载体pET28a
‑
RaADH；将重组载体pET28a
‑<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双酶偶联合成高浓度(S)
‑
构型玻色因的方法，其特征在于，所述方法为：以含短链醇脱氢酶LkCR编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎后的粗酶液作为催化剂，以β
‑
丙酮木糖苷为底物，以NAD
+
或NADP
+
为辅酶，加入辅助催化剂和辅底物驱动辅酶循环，以pH 5.5～8.5的缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度为25～45℃，300～600rpm条件下反应完全后，反应液分离纯化，获得(S)
‑
羟丙基四氢吡喃三醇，即(S)
‑
构型玻色因；所述辅助催化剂包括含葡萄糖脱氢酶BmGDH、甲酸脱氢酶AaFDH或是醇脱氢酶RaADH的编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎获得的粗酶液；所述辅底物包括葡萄糖、甲酸铵、异丙醇。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述短链醇脱氢酶LkCR编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶BmGDH编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述甲酸脱氢酶AaFDH编码基因核苷酸序列如SEQ IDNO.5所示，所述醇脱氢酶RaADH编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅助催化剂为含醇脱氢酶RaADH编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或湿菌体破碎获得的粗酶液；所述辅底物为异丙醇。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应体系中，催化剂加入量以湿菌体重量计为20～100g/L；催化剂与辅助催化剂以质量比1:1混合；所述底物加入终浓度为400～1000...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖延铭，张飞龙，叶佳伟，梁佐楠，章银军，林小琼，张保国，应向贤，
申请(专利权)人：浙江英沃迪生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：