一种生物法催化合成D-葡萄糖醛酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物法催化合成D

【技术实现步骤摘要】
一种生物法催化合成D
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葡萄糖醛酸的方法


[0001]本专利技术属于D
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葡萄糖醛酸的酶催化生产领域，特别涉及一种生物单酶催化合成D
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葡萄糖醛酸的方法。

技术介绍

[0002]D
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葡萄糖醛酸(C6H
10
O7，D
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glucuronic acid)，是一种葡萄糖的伯醇羟基被氧化形成羧基形成的化合物，其在水中的稳定性不佳，易与呋喃环的3,6
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葡萄糖醛酸内酯在水中达到互变平衡。
[0003]葡萄糖醛酸广泛存在于自然界的动植物体内，在动物和植物体内分别以组织配合物和α
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糖醛酸的形式存在，如人体连接组织中的硫酸软骨素、印度出口的卡拉亚树脂胶等。D
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葡萄糖醛酸还是一种十分高效的肝脏解毒剂，葡萄糖醛酸及其衍生物具有葡萄糖醛酸化特性，在肝脏中可以结合带有酚羟基、羟基、氨基和醇羟基等基团的内源及外源有毒物质，生成葡萄糖醛酸化物，从而增加其水溶性，便于通过肾脏尿液或者汗液排出。另外，葡萄糖醛酸还有消炎抗菌的作用，其可以降低血液中高浓度的胆固醇和甘油三酯，因此也可以间接地有助于消化，被广泛用于化妆品和护肤品以及各种饮料食品之中。葡萄糖醛酸还可以作为合成抗坏血酸、葡萄糖胺和D
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葡萄糖二酸的前体，葡萄糖在相关酶的作用下可以转化为葡萄糖醛酸，后葡萄糖醛酸作为中间物质在酶的催化下，构型发生变化，可以直接变成L
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抗坏血酸。因此，D
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葡萄糖醛酸被认定为“生物质的高附加值化学品”。
[0004]目前D
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葡萄糖醛酸的生产方法主要有：化学氧化法、多糖水解法和生物发酵法。
[0005]化学氧化法是最常见的研究最多的葡萄糖醛酸生产方法，根据培养条件的不同，可以分为均相催化氧化法和非均相催化氧化法，均相催化氧化法是指催化剂和反应物在同一个均相体系中，可以做到反应柔和、反应效率高、选择性高的优势，但是反应过程缺乏有效的控制，后续分离提纯操作困难，非均相催化氧化法是利用固体催化剂，气体为反应物选择性催化糖醛酸的底物，在气固两相的协同作用下，进行的催化氧化反应，相对于均相催化氧化反应，非均相反应除了反应温和、选择性高的优势外，还有过程简单、成本低廉、分离后续操作简便的特点，因此非常具有前景。根据催化剂的不同可以分为无机氧化法和催化氧化法，
[0006]无机氧化法主要是利用无机催化剂对反应的前体或者中间体进行催化生产葡萄糖醛酸，包括浓硝酸氧化法、高锰酸钾氧化法等，我国生产葡萄糖醛酸主要是淀粉浓硝酸氧化法，此方法反应体系复杂，产物得率低，环境污染严重，分离提纯困难，缺点较为明显。
[0007]多糖水解法主要是通过酶、酸、碱来水解含有糖醛酸的多糖，从而得到葡萄糖醛酸的过程。目前袁华等报道了用水萃取全纤维素、用碱水解棉花和纤维素、氯水溶液氧化纤维素等来制备葡萄糖醛酸。但是该方法需要用到高浓度的酸和碱，反应条件较为剧烈，对环境有一定的污染对人体健康也有一定的损害，且回收困难收率低下，故一直未能用于大规模应用。
[0008]生物发酵法是目前研究葡萄糖醛酸产品生产的热点，生物法是利用生物细胞或者
相关酶对葡萄糖醛酸的前体或者原始底物进行催化，以高产葡萄糖醛酸，此方法相对温和环保、环境污染小。郑书香等利用大肠杆菌表达嗜热菌中和小鼠肾脏中的肌醇氧化酶MIOX，该酶可以一步催化肌醇生产葡萄糖醛酸，操作简单，成本低廉，但是MIOX酶的水中稳定性和酶本身的活性有待提高，在水中的稳定性不高，易与葡萄糖醛酸内酯在水中达到互变平衡。Kratzsch E等在人类羊膜中首次发现了UDP
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葡萄糖脱氢酶，该酶可以催化UDP
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葡萄糖醛酸，而UDP
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葡萄糖醛酸可以进一步高效合成D
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葡萄糖醛酸。有团队通过重组大肠杆菌，首次表达了来源于毕赤酵母的肌醇加氧酶MIOX基因，实现了肌醇的生物转化，生成葡萄糖醛酸，实现葡萄糖醛酸产量20mg/L，为单酶生物法生产葡萄糖醛酸提供了新的思路。Eric Shiue等通过对比实验分析，肌醇加氧酶MIOX是从葡萄糖到葡萄糖二酸这条代谢途径中活性最低的关键酶(途径主要包括Ino1、MIOX、Udh三种酶)，Eric Shiue团队探索了增加MIOX溶解度的蛋白质融合标记和增加MIOX活性的定向进化。N端SUMO与MIOX融合导致肌醇产生的D
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葡萄糖醛酸产量增加了75％，在重组大肠杆菌中10.8g/L肌醇可产生高达4.85g/L的D
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葡萄糖醛酸。Eric Shiue等首次大肠杆菌中构建了肌醇氧化途径，过量表达了肌醇氧化酶(MIOX)，催化底物肌醇得到D
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葡萄糖醛酸产量3.94g/L。江南大学康振、陈坚等通过重组大肠杆菌，首次表达了来源于毕赤酵母的肌醇加氧酶MIOX基因，实现了肌醇的生物转化，生成葡萄糖醛酸，实现葡萄糖醛酸产量20mg/L，产量较低，因此，亟待开发出一种新的低成本，低污染，更高产率的生产D
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葡萄糖醛酸的方法。

技术实现思路

[0009]本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，针对肌醇氧化酶活性低的弊端，选择了一种肌醇氧化酶，并优化了肌醇氧化酶MIOX的发酵和诱导条件(如图5)，提供一种生物催化合成D
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葡萄糖醛酸的方法，该方法通过体外单酶催化低成本的肌醇生产D
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葡萄糖醛酸，区别于以往的全细胞催化法和超声破碎法，此方法利用了反复
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40℃冻融产酶菌，使得细胞的细胞壁变得脆弱，因而更有利于胞外底物与胞内酶接触反应，从而具有D
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葡萄糖醛酸产率和原料转化率较高，生产成本低，无污染等优点。
[0010]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0011]一种生物法催化合成D
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葡萄糖醛酸的方法，利用重组大肠杆菌PET
‑
28(+)
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Mm
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MIOX表达肌醇加氧酶，反复冻融后加入底物肌醇(环己六醇，C6H
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O6)进行全细胞催化反应，得D
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(+)
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葡萄糖醛酸。
[0012]所述肌醇加氧酶来源于小鼠肝脏(Marmota monax)，肌醇加氧酶的编码基因如SEQ ID NO：1所示。
[0013]全细胞催化反应温度为30～35℃，反应时间为3～4小时。
[0014]所述全细胞催化反应的体系为：50～80mmol/L Tris
‑
HCl缓冲液，2～4mmol/L L
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半胱氨酸，1～3mmol/L硫酸亚铁铵，5～10U/mL肌醇氧化酶，8～10g/L肌醇，pH为7.5～8.0。
[0015]所述反复冻融步骤是在
‑
40℃冰箱进行3～4轮的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物法催化合成D
‑
葡萄糖醛酸的方法，其特征在于，利用重组大肠杆菌PET
‑
28(+)
‑
Mm
‑
MIOX表达肌醇加氧酶，反复冻融后加入底物肌醇进行全细胞催化反应，得D
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葡萄糖醛酸。2.根据权利要求1所述的生物法催化合成D
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葡萄糖醛酸的方法，其特征在于，所述肌醇加氧酶来源于小鼠肝脏(Marmota monax)，肌醇加氧酶的编码基因如SEQ ID NO：1所示。3.根据权利要求1所述的生物法催化合成D
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葡萄糖醛酸的方法，其特征在于，全细胞催化反应温度为30～35℃，反应时间为3～4小时。4.根据权利要求1所述的生物法催化合成D
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葡萄糖醛酸的方法，其特征在于，所述全细胞催化反应的体系为：50～100mmol/L Tris
‑
HCl缓冲液，2～4mmol/L L
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半胱氨酸，1～3mmol/L硫酸亚铁铵，5～10U/mL肌醇氧化酶，8～10g/L肌醇，pH为7.5～8.0。5.根据权利要求1所述的生物法催化合成D
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葡萄糖醛酸的方法，其特征在于，所述反复冻融步骤是冻融破壁，在
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40℃～
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80℃冰箱进行3～4轮的冻融。6.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：章文明，胡海波，姜岷，信丰学，蒋羽佳，姜万奎，万子健，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：