一株亚硝酸盐积累型反硝化无色杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株亚硝酸盐积累型反硝化无色杆菌及其应用。本发明专利技术的亚硝酸盐积累型反硝化无色杆菌PJ5已于2022年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.25657。该菌株含有膜结合硝酸还原酶和氧化亚氮还原酶的编码基因，能够将硝酸盐氮转化为亚硝酸盐氮实现亚硝酸盐氮的稳定积累，同时能够将环境中的氧化亚氮转化为氮气，减少温室气体的排放。该菌株与厌氧氨氧化工艺联用可同步脱除污水中的氮和有机物、解决出水中硝酸盐积累的问题。该菌株还可通过竞争和亚硝酸盐氮的抑制作用防控硫酸盐还原菌引发的油藏酸化以及各类管道腐蚀。发的油藏酸化以及各类管道腐蚀。发的油藏酸化以及各类管道腐蚀。

【技术实现步骤摘要】
一株亚硝酸盐积累型反硝化无色杆菌及其应用


[0001]本专利技术属于工业微生物技术和环境微生物
，具体涉及一株亚硝酸盐积累型反硝化无色杆菌及其应用，该异养反硝化无色杆菌菌株能够还原硝酸盐氮、积累亚硝酸盐氮，可用于废水脱氮和防控硫酸盐还原菌引发危害等领域。

技术介绍

[0002]废水中的氮通常以有机氮、氨氮、硝酸盐氮和亚硝酸盐氮四种形态存在。生物法和化学法是废水脱氮的主要方法。化学法通常只能去除氨氮，处理费用高，并且可能产生二次污染。生物法不但能通过硝化和反硝化作用将污水中的氮转化为氮气从污水中去除，还能去除废水中的有机物，是污水脱氮处理的主流工艺。传统生物脱氮途径一般包括氨化、硝化和反硝化阶段。在厌氧环境下，微生物通过氨化作用将有机氮转化为氨氮；在好氧环境下，硝化菌通过硝化作用把氨氮转化为硝酸盐氮；随后在缺氧环境下，反硝化菌通过反硝化作用把硝酸盐氮转化为氮气。与上述传统生物脱氮相比，厌氧氨氧化是一种新型生物脱氮工艺，脱氮效率高，能够大幅度节约能耗，减少污泥产量，具有良好的应用价值，是废水脱氮领域的研究热点。厌氧氨氧化以硝酸盐氮为电子受体、以氨为电子供体，进行硝酸盐氮还原反应或将亚硝酸盐氮转化为氮气。实现厌氧氨氧化的前提是获得稳定的亚硝酸盐氮作为电子受体。目前，部分亚硝化和部分反硝化是实现亚硝酸盐氮积累的主要途径。现有技术很难实现稳定的部分亚硝化，且部分亚硝化与厌氧氨氧化联用技术处理的污水中含有大量硝酸盐氮。部分反硝化与厌氧氨氧化技术联用可以同步脱氮除有机物，解决出水中硝酸盐积累的问题，具有操作简单、运行稳定等优点，表现出巨大的应用前景。
[0003]硝酸盐还原菌及其代谢中间产物还能有效抑制硫酸盐还原菌的生长代谢，可用于防控油藏酸化和管道防腐领域。硫酸盐还原菌广泛存在于缺氧的自然环境中。其代谢产生的H2S是一种酸性、易燃、具有臭味的有毒气体。在油田生产过程中，SRB及其代谢产生的H2S可导致油藏酸化以及注水管网、抽油装置、集输管道等腐蚀穿孔，严重危害着油田的生产安全和经济效益。向油藏储层中注入硝酸盐可以激活地下硝酸盐还原菌，实现对硫酸盐还原菌生长代谢的抑制：NRB在与SRB竞争中占据优势，能够优先利用油藏中有限的有机物作为电子供体，对硫酸盐还原菌生长代谢具有明显抑制作用；硝酸盐还原菌代谢产生的中间物质NO2‑
是异化亚硫酸盐还原酶的竞争性抑制剂，对硫酸盐还原菌代谢产H2S具有抑制作用。
[0004]基于以上应用和技术需求，本专利提供一株反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）PJ5，该菌株能够将硝酸盐氮还原为亚硝酸盐氮，实现亚硝酸盐氮的稳定积累。该菌株可以与厌氧氨氧化技术联用，实现污水同步脱氮除有机物。此外，该菌株对硫酸盐还原菌及其代谢产H2S的抑制作用使其在防控油藏酸化和管道防腐领域具有巨大的应用价值。

技术实现思路

[0005]为了实现厌氧氨氧化技术中稳定的亚硝酸氮积累、同步脱除污水中的氮和有机
PJ5、其菌悬液、其培养液、含有其的菌剂及营养剂按照1%
‑
5%的用量由注水井注入地下，利用该菌的生长代谢防控硫酸盐还原菌导致的油藏酸化。
[0013]菌种保藏信息保藏时间：2022年09月07日；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号：CGMCC No.25657；保藏单位地址：保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；分类命名：反硝化无色杆菌Achromobacter denitrificans。
附图说明
[0014]图1为菌株PJ5菌落形态及革兰氏染色结果；图2为菌株PJ5反硝化基因PCR产物凝胶电泳图；图3为菌株PJ5硝酸盐氮还原积累亚硝酸盐氮时间曲线；图4为菌株PJ5对油水样中硫酸盐还原菌的抑制效果。
[0015]具体实施方式：下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。实施例应理解为说明性的，本专利技术并不限于以下实施例。本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。
[0016]实施例1：菌株PJ5的分离、鉴定与保藏（1）培养基的组成菌株富集培养基：2 g C4H4O4Na2、2 g NaNO3、0.5 g FeSO4·
7H2O、0.6 g Na2HPO4、0.2 g KH2PO4、0.3 g MgSO4·
6H2O、0.01 g CaCl2、1000 mL 蒸馏水、pH 7.2，121℃高压蒸汽灭菌后使用。复筛培养基：在上述富集培养基的基础上添加1 mL溴百里酚蓝（1.5%溶于无水乙醇）、1.5%琼脂；LB液体培养基：5 g 酵母浸粉、10 g 蛋白胨、5 g NaCl、1000 mL蒸馏水、pH7.2，121℃高压蒸汽灭菌后使用。LB 固体培养基则是在上述LB液体培养基中添加1.5%的琼脂制备而成。
[0017]（2）菌株的分离与纯化菌株Achromobacter denitrificans PJ5分离自油田采出液。菌株分离的具体步骤如下：将5 ml油田采出液接种到盛有富集培养基的塑料瓶中，排除多余空气，拧紧瓶盖于恒温箱培养至有气体产生。用平板稀释涂布法从上述培养液中分离目标菌株：取 1 mL 培养液到 9 mL无菌生理盐水中，逐级稀释，取10
‑6、10
‑7和 10
‑8三个梯度涂布于上述复筛培养基，于16
‑
45℃下培养至长出单菌落。由于反硝化细菌硝酸还原酶的作用，硝酸盐还原为亚硝酸盐，使培养基呈碱性，培养基颜色由绿色变为蓝色。用接种环挑选阳性反应单菌落在新的LB固体培养基上划线纯化获得单菌株。
[0018]（3）菌株的鉴定通过初染、媒染、脱色、复染等四个步骤对所述菌株进行革兰氏染色，染色后于普通光学显微镜下观察菌株形状和染色情况。结果表明所述菌株革兰氏染色为阴性，菌体呈杆状。进一步通过16S rRNA序列分析对所述菌株的种属信息进行鉴定。具体步骤如下：利用基因组提取试剂盒提取菌株基因组；利用引物27f（5
´‑
AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
‑3´
）
和1492r（5
´‑
GGT TAC CTT GTTACG ACT T
‑3´
）通过PCR扩增获得菌株16S rRNA基因；PCR反应条件为，94℃预变性5min，94℃变性30s、55℃退火45s、72℃延伸90s、循环30个周期，72℃延伸10min；将得到的PCR产物进行胶回收纯化，纯化后的PCR扩增产物委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序；将测序后得到菌株的16S rRNA序列提交到Genbank与其他菌株16S rRNA序列进行比对，发现菌株与Achromobacter denitrificans的进化距离最近，属于反硝化无色杆菌属，将其命名为Achromobacter denitrificans PJ5。
[0019]（4）菌株的保藏将所述菌株接种于5 mL液体LB培养基中过夜培养，取2 mL加入到盛有甘油的冻存本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株积累亚硝酸盐氮的异养型反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans ）PJ5，保藏编号为CGMCC No.25657。2.一种权利要求1所述的积累亚硝酸盐氮的异养型反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans） PJ5、其培养液、其菌悬液或其菌剂在污水净化处理中的应用或在制备污水处理的产品和设备中的应用。3.一种权利要求1所述的反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans） PJ5、其培养液、其菌悬液或其菌剂在微生物采油、防控油藏酸化以及各类管道腐蚀中的应用或在制备上述应用产品或设备中的应用。4.一种产品，其活性成分为权利要求1所述的反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans）PJ5菌株或其培养液、其菌悬液、其菌剂，所述产品具有污水处理和微生物采油、防控油藏酸化以及各类管道腐蚀中任意一种功能。5.一种权利要求1所述的反硝化无色杆菌（Achromobacter denitrificans） PJ5的培养液、其菌悬液和其菌剂的制备方法，其特征在于：（1）培养液的制备方法：将所述菌株接种于LB液体培养基中16
‑
45℃培养12
‑
36h；将上述种子液按照1
‑
5%接种量接种于无菌LB液体培养基中于16
‑
45℃培养时间12
‑
36h，溶氧量控制在100％的空气饱和度；或将上述种子液按照1
‑
5%接种量接种于含磷酸氢二钠0
‑
2 g/L、磷酸二氢钾0
‑
2 g/L、硝酸钠0
‑
5 g/L、硫酸亚铁0
‑
1 g/L、六水合硫酸镁0
‑
1 g/L、氯化钙0.01 g/L、酵母浸粉0.01 g/L，糖蜜0
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高配科，谢欣然，高庆凤，贾传兴，丁宁，陈峻峰，王仁君，
申请(专利权)人：曲阜师范大学，
类型：发明
国别省市：