一种基于双嵌段DNA探针的球形核酸及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种基于双嵌段DNA探针的球形核酸及其制备方法与应用。球形核酸以金纳米颗粒为载体，在其表面修饰双嵌段DNA探针，双嵌段DNA探针由AP，polyA20

【技术实现步骤摘要】
一种基于双嵌段DNA探针的球形核酸及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于分析检测和医学诊断
，尤其涉及一种基于双嵌段DNA探针的球形核酸及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]核酸，包括脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)以及核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)，是生物体内最不可或缺的生物大分子之一。1958年Francis Harry ComptonCrick提出了中心法则，并于1970年发表于Nature。核酸作为遗传物质的作用机理逐渐被人们所接受，遗传的研究也逐渐深入分子层次。其中，DNA储存了编码蛋白质的氨基酸序列的遗传信息，RNA在基因编码、解码、调控以及表达等方面发挥了重要的作用。因此核酸可用作生物标志物进行疾病诊断与辅助治疗。目前已经建立了很多信号放大方法用于检测复杂样品中的核酸，如聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)、滚环扩增技术(Rolling circle amplification，RCA)以及基于切口酶(Nicking endonucleases)和核酸外切酶III(Exo III)的信号放大技术。但是，PCR需要昂贵的热循环仪器，限制了其在定点分析上的应用，RCA与基于酶切反应的信号放大技术需要酶辅助，而酶的费用高昂且脆弱容易失活，都限制了其在核酸检测上的发展。
[0003]为了克服上述问题，基于DNA链取代反应的信号放大技术逐渐发展起来。DNA链取代反应是用一条单链DNA取代双链DNA，同时产生另一条DNA的过程，整个过程不需要酶参与。近年来，基于Toehold介导的DNA链置换反应(Toehold strand displacement reaction，TSDR)的无酶信号放大体系作为核酸检测新的信号放大的方法已被广泛关注。Toehold指的是悬挂于双链DNA末端的由6
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10个碱基组成的单链DNA片段。DNA链取代反应从DNA粘性末端Toehold区域开始，即从被取代的双链DNA的单链与反应物的单链DNA完全互补的区域开始。2000年Yurke等设计出了第一台DNA驱动的分子机器，并系统的论证了Toehold介导的链置换反应。这种反应主要是由于单链DNA会选择互补性最强的单链分子形成双链DNA，并且新的双链DNA的结构更稳定，吉布斯自由能低于旧的双链DNA。
[0004]纳米金(AuNP)因其优异的生物相容性和淬灭效应，使其成为结合核酸探针，进行荧光检测分析的优秀支架材料。自从1996年Chad发表了通过金硫键将巯基修饰的核酸修饰在纳米金表面形成球形核酸(SNA)的方法后，便得到广泛的应用。然而，巯基修饰核酸的价格十分昂贵，而且通过金硫键形成DNA
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AuNP难以精确控制表面修饰的寡核苷酸的方向和构象，也很难精细调节其杂交能力。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于，针对现有技术的上述不足，提供了一种基于双嵌段DNA探针的球形核酸及其制备方法与应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下的技术方案：
[0007]本专利技术的第一目的提供一种基于双嵌段DNA探针的球形核酸，所述球形核酸是以
金纳米颗粒为载体，在其表面修饰双嵌段DNA探针，所述双嵌段DNA探针包括AP、polyA20
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TP和修饰有荧光基团的FP，所述polyA20
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TP中的TP为第一单链DNA，所述AP为第二单链DNA，所述FP为第三单链DNA，所述第一单链DNA包括3'
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5'依次排列的第一Toehold段、第一区段、第二Toehold段和第二区段，所述第一区段与所述第二单链DNA部分互补，所述第二区段与所述第三单链DNA完全互补，所述第一Toehold段用于识别靶序列，所述第二Toehold段用于识别燃烧链FS序列，所述第三单链DNA的3'端修饰有荧光基团，所述荧光基团靠近金纳米颗粒表面，所述第一单链DNA的5'端修饰有一段含有20个连续的腺嘌呤A的序列polyA20，所述polyA20段修饰到所述金纳米颗粒表面形成所述球形核酸。
[0008]进一步的，所述荧光基团包括FAM、TET、CY3、CY5或ROX中的任一种。
[0009]进一步的，所述polyA20
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TP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述AP的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述FP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述燃烧链FS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
[0010]本专利技术的第二目的是提供上述球形核酸的制备方法，包括以下具体步骤：
[0011]步骤S1，金纳米颗粒的制备
[0012]将氯金酸的水溶液加热至沸腾，搅拌下加入柠檬酸钠溶液，沸腾后持续加热，停止搅拌，自然冷却至室温，获得金纳米颗粒溶液；
[0013]步骤S2，将polyA20
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TP，AP和修饰有荧光基团的三条DNA单链按预设的比例混合，混合均匀后加入缓冲液和氯化镁溶液，得混合溶液，将混合液放入PCR扩增仪中执行退火程序杂交，获得双嵌段DNA探针；
[0014]步骤S3，球形核酸的制备
[0015]将步骤S2制备得到的双嵌段DNA探针加入到步骤S1制得的纳米金溶液中，震荡过夜，然后加入SDS，然后用NaCl溶液进行盐老化，离心，弃去上清液，用缓冲液分散沉淀，沉淀物为球形核酸。
[0016]进一步的，步骤S2中，所述polyA20
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TP，AP和修饰有荧光基团的三条DNA单链的摩尔浓度比为1：(1.5～2)：1。
[0017]本专利技术的第三目的是提供上述球形核酸在核酸检测试剂中的应用。
[0018]本专利技术的第四目的是提供一种核酸检测体系，包括上述的球形核酸和燃烧链FS，所述燃烧链FS为第四单链DNA，所述第四单链DNA与所述第一单链DNA完全互补。
[0019]进一步的，所述球形核酸与所述燃烧链FS的摩尔浓度比为2.5：(400～700)。
[0020]需要说明的是，核酸检测体系包含的球形核酸和燃烧链FS，两者的摩尔浓度比为2.5：(400～700)，可以理解为包括但不限于2.5:400、2.5:450、2.5:500、2.5:550、2.5:600、2.5:650、2.5:700，以核酸检测体系中含有2.5nM的球形核酸为例，燃烧链FS的摩尔浓度可以为400nM、450nM、500nM、550nM、600nM、650nM、700nM，同时应包括但不限于含有包含在上述任意两个数值之间的某具体数值摩尔浓度的燃烧链FS，例如但不限于包含在400～450nM之间的420nM、435nM等，不再一一赘述。该核酸检测体系中燃料链过量不会影响polyA20
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TP的数量，也不会影响FP上的荧光基团产生的荧光信号。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于双嵌段DNA探针的球形核酸，其特征在于，所述球形核酸是以金纳米颗粒为载体，在其表面修饰双嵌段DNA探针，所述双嵌段DNA探针包括AP、polyA20
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TP和修饰有荧光基团的FP，所述polyA20
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TP中的TP为第一单链DNA，所述AP为第二单链DNA，所述FP为第三单链DNA，所述第一单链DNA包括3'
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5'依次排列的第一Toehold段、第一区段、第二Toehold段和第二区段，所述第一区段与所述第二单链DNA部分互补，所述第二区段与所述第三单链DNA完全互补，所述第一Toehold段用于识别靶标序列，所述第二Toehold段用于识别燃烧链FS序列，所述第三单链DNA的3'端修饰有荧光基团，所述荧光基团靠近金纳米颗粒表面，所述第一单链DNA的5'端修饰有一段含有20个连续的腺嘌呤A的序列polyA20，所述polyA20段修饰到所述金纳米颗粒表面形成所述球形核酸。2.如权利要求1所述的基于双嵌段DNA探针的球形核酸，其特征在于，所述荧光基团包括FAM、TET、CY3、CY5或ROX中的任一种。3.如权利要求2所述的基于双嵌段DNA探针的球形核酸，其特征在于，所述polyA20
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TP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述AP的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述FP的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述燃烧链FS的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。4.如权利要求1
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3中任一项所述的球形核酸的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：S1、...

【专利技术属性】
技术研发人员：商志伟，林美华，顾梦寒，夏帆，
申请(专利权)人：中国地质大学武汉，
类型：发明
国别省市：