一种对CRISPR/Cas12a酶进行绝对测活的方法技术

本发明专利技术涉及生物制品技术领域，且公开了一种对CRISPR/Cas12a酶进行绝对测活的方法，包括以下步骤：S1：准备仪器、试剂、样本；仪器包括罗氏480荧光定量PCR仪；试剂包括ssDNA探针、Cry1C

【技术实现步骤摘要】
一种对CRISPR/Cas12a酶进行绝对测活的方法


[0001]本专利技术涉及生物制品
，具体为一种对CRISPR/Cas12a酶进行绝对测活的方法。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas系统(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat and CRISPR
‑
Associated Protein)是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统，可以保护它们免受噬菌体、病毒和质粒的入侵。随着对CRISPR/Cas系统的研究深入，人们发现了CRISPR/Cas12a(Cpf1)。
[0003]CRISPR/Cas12a(Cpf1)是一种RNA指导的核酸切割酶。Cas12a蛋白可以特异性识别双链DNA中的PAM序列(富含T碱基的序列)，使PAM序列的下游靶双链DNA序列出现局部熔化解链，从而与特异性的crRNA互补结合形成R环结构，Cas12a蛋白的RuvC核酸酶结构域即可对双链DNA进行特异性切割。完成双链DNA的切割后，Cas12a PAM远端仍具有切割活性可对单链DNA进行非特异性反式切割。
[0004]近年来随着体外诊断行业的发展，人们对体外诊断的准确性、及时性提出了更高的要求。特别是新冠疫情爆发以来，现场即时检测(Point of Care Test，POCT)越来越受到人们重视，而重组聚合酶恒温扩增反应(recombinase polymerase amplification，RPA)和CRISPR/>‑
Cas12a的结合在灵敏度、特异性以及检测速度上均具有突出优势，被认为是新一代分子诊断技术，具有改变分子诊断领域格局的前景。
[0005]随着RPA
‑
CRISPR/Cas12a结合进行核酸检测的方法及试剂盒的开发研究，CRISPR/Cas12a酶的需求量也越来越大，很多原料酶生产厂商开始进行了CRISPR/Cas12a原料酶的开发生产。但是目前市场上CRISPR/Cas12a原料酶均是以浓度为单位进行售卖，没有对酶活进行标定，造成不同生厂商在同一浓度下CRISPR/Cas12a酶的活性差异很大，且同一生厂商不同批次CRISPR/Cas12a酶之间的活性差异也很大，给下游的使用造成很大困扰。

技术实现思路

[0006](一)解决的技术问题
[0007]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种对CRISPR/Cas12a酶进行绝对测活的方法，对CRISPR/Cas12a酶活测定提出了一个标准，使不同批次间CRISPR/Cas12a酶的性能更统一，减少批间差。
[0008](二)技术方案
[0009]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种对CRISPRCas12a酶进行绝对测活的方法，包括以下步骤：
[0010]S1：准备仪器、试剂、样本；
[0011]仪器包括罗氏480荧光定量PCR仪；
[0012]试剂包括ssDNA探针、Cry1C
‑
crRNA、RNase抑制剂、Cas12a酶；
[0013]样本包括δ
‑
内毒素Cry1C基因dsDNA；
[0014]S2：将δ
‑
内毒素Cry1C基因dsDNA提前制备好，稀释到5ng/μL，并分装后
‑
20℃放置备用；
[0015]S3：Cry1C
‑
crRNA制备
[0016]Cry1C
‑
crRNA制备通过合成Cry1C
‑
crRNA后，再HPLC纯化，合成的crRNA为干粉状态，10000rpm离心5min后，根据每OD的nmol数(或者COA)加入相应体积的无RNase水，室温静置2min，涡旋混匀离心后制备成10μM的工作液，分装到0.2mL PCR管中，每管20μL，
‑
80℃放置备用；
[0017]S4：ssDNA探针制备
[0018]ssDNA探针制备通过合成ssDNA后，再HPLC纯化，合成的ssDNA为干粉状态，10000rpm离心5min后，根据每OD的nmol数(或者COA)加入相应体积的1
×
TE buffer，室温静置2min，涡旋混匀离心后制备成100μM的母液，
‑
20℃放置。取探针母液5μL，加入45μL的1
×
TE buffer，混匀离心后为10μM的工作液备用；
[0019]S5：CRISPR/Cas12a荧光反应体系配制
[0020]在其余组分过量的情况下，Cas12a酶荧光反应体系中加入不同终浓度(2倍浓度梯度)的Cas12a酶，每个浓度梯度进行3复孔检测，以不加Cas12a酶的反应孔为空白对照；其具体放映体系如下表：
[0021][0022]S6：配制好的反应体系，涡旋混匀离心后，加入96孔PCR板中，光学贴膜密封后，在罗氏480荧光定量PCR仪上进行反应并采集荧光；其具体反应程序如下表：
[0023]37℃1min采集一次荧光60循环98℃2min1循环
[0024]S7：计算每个浓度梯度在30min时的3复孔荧光值的平均值，排除其中荧光值过低和荧光值进入平台期的Cas12a酶浓度梯度，根据1U的酶活定义计算其余合适稀释梯度的酶活，并根据检测时稀释倍数计算出待测Cas12a酶的酶活。
[0025]优选的，所述S2中，δ
‑
内毒素Cry1C基因dsDNA的具体序列号为：CTCTCTCTCACTTGTTCAGTTCTTGGTTTCTAACTTTGTGCCAGGAGGAGGATTCCTTGTTGGACTTATCGACTTCGTTTGGGGAATCGTTGGACCTTCTCAATGGGATGCATTTCTCGTTCAGATCGAACAGCTCATCAACGAAAGAATCGCTGAGTTCGCTAGGAATGCTGCTATTGCTAACCTTGAAGGACTTGGAAACAACTTCAACATCTACGTGGAGGCATTCAAGGAATGGGAAGAAGATCCTAACAACCCAGCAACCAGGACCAGAGTGATCGATAGGTTCCGTATCCTTGATGGACTTCTTGAAAGGGACATTCCTAGCTT。
[0026]优选的，所述Cry1C
‑
crRNA的具体序列号为：5
’‑
AAUUUCUACUGUUGUAGAUUUAGCGACUCAAGCGAUCCUUAC
‑3’
。
[0027]优选的，所述S4中，ssDNA的具体序列号为：5
’‑
FAM
‑
TTATT
‑
BHQ1
‑3’
。
[0028](三)有益效果
[0029]与现有技术相比，本专利技术提供了一种对CRISPRCas12a酶进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对CRISPRCas12a酶进行绝对测活的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：准备仪器、试剂、样本；仪器包括罗氏480荧光定量PCR仪；试剂包括ssDNA探针、Cry1C
‑
crRNA、RNase抑制剂、Cas12a酶；样本包括δ
‑
内毒素Cry1C基因dsDNA；S2：将δ
‑
内毒素Cry1C基因dsDNA提前制备好，稀释到5ng/μL，并分装后
‑
20℃放置备用；S3：Cry1C
‑
crRNA制备Cry1C
‑
crRNA制备通过合成Cry1C
‑
crRNA后，再HPLC纯化，合成的crRNA为干粉状态，10000rpm离心5min后，根据每OD的nmol数(或者COA)加入相应体积的无RNase水，室温静置2min，涡旋混匀离心后制备成10μM的工作液，分装到0.2mLPCR管中，每管20μL，
‑
80℃放置备用；S4：ssDNA探针制备ssDNA探针制备通过合成ssDNA后，再HPLC纯化，合成的ssDNA为干粉状态，10000rpm离心5min后，根据每OD的nmol数(或者COA)加入相应体积的1
×
TEbuffer，室温静置2min，涡旋混匀离心后制备成100μM的母液，
‑
20℃放置。取探针母液5μL，加入45μL的1
×
TEbuffer，混匀离心后为10μM的工作液备用；S5：CRISPR/Cas12a荧光反应体系配制在其余组分过量的情况下，Cas12a酶荧光反应体系中加入不同终浓度(2倍浓度梯度)的Cas12a酶，每个浓度梯度进行3复孔检测，以不加Cas12a酶的反应孔为空白对照；S6：配制好的反应体系，涡旋混匀离心后，加入96孔PCR板中，光学贴膜密封后，在罗氏48...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨林，王笑影，任黎明，张惠丹，
申请(专利权)人：苏州乾康基因有限公司，
类型：发明
国别省市：