一种CSFV-E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒及检测方法技术

本申请涉及生物检测的技术领域，具体公开了一种CSFV

【技术实现步骤摘要】
一种CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒及检测方法


[0001]本申请涉及生物检测的
，具体涉及一种CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的猪的一种高度接触性传染病，该传染病以高热和全身广泛性出血为主要特征，能导致猪群的大规模发病和死亡，严重危害我国养猪业的发展。
[0003]疫苗免疫接种是猪瘟防控的重要措施，其中，猪瘟兔化弱毒疫苗(C株)被认为是最有效的猪瘟疫苗之一，猪瘟C株疫苗的广泛应用对于控制猪瘟流行起到了关键作用。但是，该类疫苗免疫并未彻底阻断CSFV的传播；并且在生产实践中，常因免疫程序不合理造成免疫失败，导致了猪瘟流行呈现典型和非典型猪瘟共存、免疫耐受和带毒综合征共存等现象。因此，定期开展猪群免疫水平监测分析以清除免疫水平低下的猪，对控制猪瘟流行和猪瘟净化具有十分重要的意义。
[0004]目前，猪瘟抗体检测的方法主要有荧光抗体中和试验(FVNT)和酶联免疫法(ELISA)。其中，FVNT可作为猪瘟抗体检测的金标准，但该检测方法对试验条件和操作人员要求高，且耗时长，仅适合专业实验室进行少量样本检测，不宜推广应用。而ELISA法操作简单，特异性强、灵敏度高、重复性好，可同时检测多个样品，且结果可靠，是目前国际上承认的唯一适合大规模应用的血清学检测方法。
>[0005]目前，ELISA抗体检测方法包括间接ELISA、阻断ELISA和化学发光ELISA等，以上方法已被广泛应用于临床实践中的猪瘟抗体水平监测。但是，上述ELISA抗体检测方法主要系将猪瘟病毒重组E2蛋白(CSFV
‑
E2)直接包被于酶标板，因蛋白表达系统的差异，使得检测方法的敏感性和特异性较差。

技术实现思路

[0006]为了提高CSFV
‑
E2抗体检测方法的敏感性和特异性，本申请提供一种CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒及检测方法。
[0007]第一方面，本申请提供一种CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒。
[0008]一种CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒，包括包被捕获抗体的酶标板、标准抗原、酶标记抗体；
[0009]所述捕获抗体为CSFV
‑
E2蛋白7C9株单克隆抗体；
[0010]所述标准抗原为杆状病毒表达的CSFV
‑
E2蛋白抗原；
[0011]所述酶标记抗体为酶标记的CSFV
‑
E2蛋白6E12株单克隆抗体。
[0012]本申请利用CSFV
‑
E2蛋白7C9株单克隆抗体作为包被于酶标板中的捕获抗体，进行捕获标准抗原，形成固相抗原；然后利用酶标记的CSFV
‑
E2蛋白6E12株单克隆抗体作为待测血清样品中CSFV
‑
E2抗体的竞争性抗体，获得了检测敏感性较高、特异性较强、重复性较好
的CSFV
‑
E2抗体的检测试剂盒。
[0013]本申请基于间接捕获包被的原理，将固相化抗原远离载体表面，使得抗原决定簇得以充分暴露；同时间接包被的抗原经捕获抗体的亲和层析作用，使得包被在固相上的标准抗原纯度大大提高，从而有效提高了检测方法的敏感性和特异性。
[0014]优选地，所述标准抗原的制备方法为：从猪瘟兔化弱毒株(C株)中提取病毒核酸，通过RT
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PCR扩增E2基因，并克隆至pFastBacHTa载体中，构建重组质粒pFastBacHTa
‑
CSFV
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E2，利用Bac
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to
‑
Bac杆状病毒表达系统，将重组质粒转入DH10Bac进行转座，获得含E2基因的重组Bacmid，提取重组Bacmid转染Sf9昆虫细胞，制备了表达E2蛋白的重组杆状病毒rBV
‑
CSFV
‑
E2株，采用Ni柱亲和层析对表达的重组E2蛋白进行纯化，得到杆状病毒表达的CSFV
‑
E2蛋白抗原，即为本申请使用的标准抗原。
[0015]E2囊膜糖蛋白是CSFV的主要结构蛋白，位于猪瘟病毒粒子外表面，能够诱导机体产生CSFV的中和抗体，具有优异的活性和免疫原性，是免疫猪免受CSFV攻击的主要保护性抗原蛋白。因此，E2糖蛋白是建立CSFV血清学检测方法的首选抗原。
[0016]在本申请中，申请人将CSFV的E2基因克隆入杆状病毒表达系统中，获得体外表达的重组E2蛋白，并将纯化的重组E2蛋白作为标准抗原，以建立CSFV
‑
E2抗体的检测方法。与原核表达的蛋白相比，利用杆状病毒表达的外源蛋白更加接近真实的天然蛋白的空间构象和功能。因此，本申请利用杆状病毒表达的蛋白作为标准抗原，能够使得抗原与待检猪血清中抗体的结合具有更强的特异性和敏感性。
[0017]优选地，所述检测试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标记抗体稀释液、洗涤液、封闭液、TMB底物液、终止液。
[0018]进一步地，所述捕获抗体的包被浓度为1
‑
4μg/mL；所述标准抗原的包被浓度为0.1
‑
0.4μg/mL。
[0019]在一个具体的实施方案中，所述捕获抗体的包被浓度可以为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL。
[0020]在一些具体的实施方案中，所述捕获抗体的包被浓度还可以为1
‑
2μg/mL、2
‑
4μg/mL。
[0021]在一个具体的实施方案中，所述标准抗原的包被浓度可以为0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.4μg/mL。
[0022]在一些具体的实施方案中，所述标准抗原的包被浓度还可以为0.1
‑
0.2μg/mL、0.2
‑
0.4μg/mL。
[0023]经过试验分析可知，当捕获抗体的包被浓度达到1
‑
4μg/mL时，同一包被浓度的标准抗原的OD
450nm
值变化不大，表明捕获抗体在酶标板上吸附达到饱和。同时，当标准抗原的包被浓度为0.1
‑
0.4μg/mL时，OD
450nm
值为1.0左右。因此，本申请将捕获抗体和标准抗原的包被浓度控制在上述范围。
[0024]进一步地，所述酶标记抗体的稀释度为1∶(6000
‑
10000)。
[0025]在一个具体的实施方案中，所述酶标记抗体的稀释度可以为1∶6000、1∶8000、1∶10000。
[0026]在一些具体的实施方案中，所述酶标记抗体的稀本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括包被捕获抗体的酶标板、标准抗原、酶标记抗体；所述捕获抗体为CSFV
‑
E2蛋白7C9株单克隆抗体；所述标准抗原为杆状病毒表达的CSFV
‑
E2蛋白抗原；所述酶标记抗体为酶标记的CSFV
‑
E2蛋白6E12株单克隆抗体。2.根据权利要求1所述CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照血清、阴性对照血清、样品稀释液、酶标记抗体稀释液、洗涤液、封闭液、TMB底物液、终止液。3.根据权利要求1所述CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体的包被浓度为1
‑
4μg/mL；所述标准抗原的包被浓度为0.1
‑
0.4μg/mL。4.根据权利要求1所述CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记抗体的稀释度为1∶（6000
‑
10000）。5.根据权利要求1所述CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为0.4
‑
0.6wt% PBSA。6.根据权利要求1所述CSFV
‑
E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述酶标记抗体稀释液为含有0.18
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0.22wt%蔗糖、浓度为0.4
‑
0.6wt%的PBSA。7.根据权利要求1所述CSFV
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E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为2.5
‑
3.5wt% BSA。8.一种CSFV
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E2抗体的阻断ELISA检测方法，其特征在于，所述检测方法是基于权利要求1
‑
7中任一项所述的CSFV
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E2抗体的阻断ELISA检测试剂盒获得的。9.根据权利要求8所述CSFV<...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丹丹，王亚玲，文晶亮，吴星亮，邢佳鹏，杨洵，李璞君，朱文鹏，陈景茹，贾玉琦，方磊，金卉，伏鹏，刘鹤，张欣，刘子瑜，
申请(专利权)人：北京金诺百泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：