定量分析利伐沙班的方法以及确定利伐沙班血药浓度的方法技术

本申请涉及利用高效液相色谱

【技术实现步骤摘要】
定量分析利伐沙班的方法以及确定利伐沙班血药浓度的方法


[0001]本专利技术属于分析化学和临床药学领域，具体而言，涉及一种定量尿液中利伐沙班(Rivaroxaban)的高效液相色谱
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质谱技术的分析方法和利用尿液中累积排泄量和排泄速率数据确定血液中利伐沙班浓度并应用于剂量调整的数学方法。

技术介绍

[0002]利伐沙班是一种直接作用于凝血因子Xa(FXa)的口服抗凝剂，2011年经美国FDA批准用于预防房颤、中风以及预防深静脉血栓和肺栓塞形成。与传统抗凝药相比，利伐沙班使用方便、生物利用度高、具有更好的疗效。其主要通过肝脏CYP450代谢酶(CYP3A4和CYP2J2)和P
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糖蛋白代谢，部分代谢物及活性药物原型通过尿液排泄。
[0003]鉴于利伐沙班药动学存在显著个体差异，在某些情况下例如肾功能不全、特殊人群、超剂量、治疗期间出血和血栓栓塞、联合给药(CYP3A4和P
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糖蛋白的底物)和评估患者依从性方面，认为对其进行治疗药物监测(therapeutic drug monitoring，TDM)具有一定临床价值。
[0004]治疗药物监测通常采集患者的血液样本进行检测，然而对于某些特殊患者，特别是老年人采血困难，而尿液作为无创性样本，取样简单，在尊重病人，减少采血次数的情况下，对于利伐沙班等能以原型从肾脏排泄的药物，考虑用尿液中的药物浓度替代血液药物浓度监测，提高个体化给药比例。
[0005]目前报道的测定人尿液中利伐沙班浓度的分析方法并不能满足临床药物治疗监测的需求。HPLC
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UV方法的灵敏度较低，前处理过程采用固相萃取方法可以提高灵敏度，但是成本较高且较耗费时间。而UHPLC
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MS采用填充吸附剂微萃取(Micro Extraction with Packed Sorbent，MEPS)方式，LC
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MS/MS和EC
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MS方法采用超声辅助乳化微萃取(Ultra Sound
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Assisted Emulsification Micro Extraction，USAEME)的方式进行前处理，过程复杂不易操作，其线性范围窄，无法满足临床对药物浓度实时监测的实际需求。
[0006]另外，国内外鲜有基于尿药参数的血药浓度监测的报道。目前缺乏包括利伐沙班在内的基于药物尿药参数的血药浓度监测的研究和实例应用。
[0007]因此亟需开发一种快速、特异、高灵敏度且高稳定性的定量分析方法来定量尿液中的利伐沙班，并利用尿液中的药物浓度数据推测血液浓度数据进而推测药效学参数，进行药物的剂量调整。

技术实现思路

[0008]本专利技术目的在于提供一种快速、准确、高灵敏度、高稳定性的对尿液中的利伐沙班进行定量分析的方法。
[0009]在一个方面，本专利技术提供了一种利用高效液相色谱
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串联质谱联用装置定量分析尿液样品中的利伐沙班的方法，所述方法包括以下步骤：
[0010](1)由尿液样品制备含有利伐沙班的样品溶液：
[0011](2)将所述样品溶液注入到所述高效液相色谱
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串联质谱联用装置中，获得质量色谱图；
[0012](3)根据所述质量色谱图使用内标法对利伐沙班进行定量分析，
[0013]其中，所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为含甲酸的乙酸铵溶液，所述流动相B为含甲酸的乙腈。
[0014]在一些实施方案中，所述梯度洗脱程序为：
[0015]0.00至1.50分钟，20体积％至80体积％流动相B；
[0016]1.50至2.50分钟，80体积％流动相B；
[0017]2.50至3.00分钟，80体积％至20体积％流动相B，
[0018]其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。
[0019]优选地，所述梯度洗脱程序为：
[0020]0.00至0.50分钟，20体积％流动相B；
[0021]0.50至1.50分钟，20体积％至80体积％流动相B；
[0022]1.50至2.50分钟，80体积％流动相B；
[0023]2.50至2.51分钟，80体积％至20体积％流动相B；
[0024]2.51至3.00分钟，20体积％流动相B，
[0025]其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。
[0026]在一些实施方案中，所述流动相A含有0.05质量％至0.25质量％的甲酸，并且含有5mM至25mM的乙酸铵。
[0027]在一些实施方案中，所述流动相B含有0.05质量％至0.25质量％的甲酸。
[0028]在一些实施方案中，所述高效液相色谱中的色谱柱为以十八烷基硅烷键合硅胶填充的色谱柱。
[0029]在一些实施方案中，所述利伐沙班的去簇电压DP为140至180V，并且所述利伐沙班的碰撞能量CE为20至50V。
[0030]在一些实施方案中，制备含有利伐沙班的样品溶液包括：向含有利伐沙班的尿液中加入内标工作液，然后加入沉淀剂，将所得混合物离心，取上清液进行复溶并混匀。优选地，所述沉淀剂是体积比为3∶1的甲醇与水的混合物，用于所述复溶的介质是体积比为3∶1的甲醇与水的混合物。
[0031]在另一个方面，本专利技术提供了一种确定利伐沙班血药浓度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0032](1)在受试者口服利伐沙班后的不同时间点收集多个尿液样品；
[0033](2)通过上述方法对所述多个尿液样品中的利伐沙班进行定量分析，得到不同时间点的利伐沙班的尿药浓度；以及
[0034](3)根据公式I由所述尿药浓度计算尿排泄数据药代动力学参数：
[0035][0036]其中，为利伐沙班经肾脏排泄速率，X
u
为t时刻排泄于尿中的原型药物累积量，X为t时刻体内的药物量，k
e
为肾脏排泄速率常数，X0为利伐沙班的给药剂量，F为吸收分数，
k
a
为吸收速率常数，k为消除速率常数，其中0≤F≤1；和
[0037]根据公式II计算利伐沙班的血药浓度：
[0038][0039]其中，V是分布容积，C是单次给药后t时刻的利伐沙班血药浓度。
[0040]在一些实施方案中，通过以下方式得到以上步骤(3)中的公式：使用WinNonlin软件建立含有排泄房室的一室药代动力学模型，根据测得的利伐沙班的尿药浓度和已知血药浓度，使用迭代法计算模型参数。
[0041]与现有技术相比，本专利技术首次应用了高效液相色谱
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串联质谱技术对尿液中的利伐沙班进行定量分析。本专利技术的方法具有灵敏度高，稳定性好，特异性强和数据重现性强等优点，具有较高的实用性和可靠性。此外，本方法分析时间短，能够在尿液中准确、高通量的定量利伐沙班。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用高效液相色谱
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串联质谱联用装置定量分析尿液样品中的利伐沙班的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)由尿液样品制备含有利伐沙班的样品溶液，其包括：向含有利伐沙班的尿液中加入内标工作液，然后加入沉淀剂，将所得混合物离心，取上清液进行复溶并混匀；(2)将所述样品溶液注入到所述高效液相色谱
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串联质谱联用装置中，获得质量色谱图；(3)根据所述质量色谱图使用内标法对利伐沙班进行定量分析，其中，所述高效液相色谱中使用由流动相A和流动相B组成的混合流动相进行梯度洗脱，所述流动相A为含甲酸的乙酸铵溶液，所述流动相B为含甲酸的乙腈。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述梯度洗脱程序为：0.00至1.50分钟，20体积％至80体积％流动相B；1.50至2.50分钟，80体积％流动相B；2.50至3.00分钟，80体积％至20体积％流动相B，其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述梯度洗脱程序为：0.00至0.50分钟，20体积％流动相B；0.50至1.50分钟，20体积％至80体积％流动相B；1.50至2.50分钟，80体积％流动相B；2.50至2.51分钟，80体积％至20体积％流动相B；2.51至3.00分钟，20体积％流动相B，其中流动相A和流动相B的总量为100体积％。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相A含有0.05质量％至0.25质量％的甲酸，并且含有5mM至25...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑昕，韩晓红，施举红，
申请(专利权)人：中国医学科学院北京协和医院，
类型：发明
国别省市：