甲基衍生化-高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法技术

本发明专利技术涉及一种甲基衍生化

【技术实现步骤摘要】
甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法


[0001]本专利技术属于血液检测
，具体涉及一种甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法。

技术介绍

[0002]水溶性维生素是能在水中溶解的一组维生素，常是辅酶或辅基的组成部分，其中包括在酶的催化中起着重要作用的B族维生素。例如，维生素包括维生素B7（Biotin，VB7）、维生素B9（folic acid，VB9）和烟酸（Nicotinic acid，NA）。
[0003]维生素B7又名维生素H、生物素或辅酶R，是一种水溶性维生素，属于B族维生素，它是多种羟化酶的辅基，是脂肪和蛋白质正常代谢不可或缺的物质，也是维持正常成长、发育及健康必要的营养素。生物素缺乏的主要表现多以皮肤症状为主，可见皮炎、湿疹，厌食和轻度贫血、脱发。糖尿病患者可以通过生物素改善血糖的调节。
[0004]烟酸又称为维生素B3，有助于促进消化系统健康，改善肠胃功能障碍和腹泻；有助于降低血液中胆固醇和甘油三酯水平；医学上还用于改善口腔炎，防止口臭。
[0005]维生素B9又叫叶酸，是一种重要的维生素，它与B12一起有利于血红细胞形成，减少贫血。孕妇缺乏叶酸会导致胎儿的脊柱裂和无脑畸形。此外，叶酸还有助于保持血液正常的同型半胱氨酸水平（衡量心脏病的重要指标），减少心脏病的发生。
[0006]目前，有关水溶性维生素的检测方法有很多种，除了传统的微生物检测法、ELISA、放射免疫分析方法，液相色谱紫外检测法（LC
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UV）和液相色谱串联质谱法（LC
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MS/MS）也越来越多地应用于维生素的检测中。但在生物样本检测中，一些含羧酸基团的水溶性维生素，常因基质效应和高背景噪音导致灵敏度差而不能满足临床的检测需求。通过前期的技术尝试，ESI电离条件下，羧酸基团一般易于去质子化而带负电荷，但维生素B7无论是在正离子还是在负离子检测模式下灵敏度都较差。
[0007]也有文献使用2
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硝基苯肼对VB7进行衍生反应进而提高其检测灵敏度（Journal of Chromatography A, 1142 (2007) 231
‑
235），但该衍生反应比较复杂，用到的试剂种类较多，而大量试剂的加入必然会稀释待测物的检测浓度，对痕量检测不利。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是在现有技术的基础上，提供一种甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法。
[0009]本专利技术的技术方案如下：一种甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法， 其中，水溶性维生素分别为：维生素B7（VB7）、维生素B9（VB9）和烟酸（NA）；上述水溶性维生素对应的同位素内标物分别为：维生素B7
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d4（VB7
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d4）、维生素B9
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d4（VB9
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d4）和烟酸
‑
d4（NA
ꢀ‑
d4）；
采用高效液相色谱串联质谱检测经过预处理的血清中的水溶性维生素，利用高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物与其对应同位素内标的质荷比的响应，使用同位素内标法定量，分别计算出3种水溶性维生素的含量，具体色谱条件为：（1）高效液相色谱条件：流动相A：0.01~0.5%甲酸水溶液；流动相B：甲醇；色谱柱为：Agilent EC C18；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0
‑
1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至30:70；在1.0
‑
2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.5
‑
3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0
‑
3.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至80:20；在3.1
‑
5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20；（2）质谱条件：在电喷雾电离模式下，采用多反应监测进行正负切换扫描；毛细管电压为3.5kV，喷嘴电压为100 V；干燥气温度为300℃，鞘气温度为325℃，干燥气流速为7 L/min，鞘气流速为11 L/min，雾化气压力30 psi；同时监测3种水溶性维生素及其对应同位素内标。
[0010]在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本专利技术采用0.01~0.5%甲酸水溶液
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甲醇作为流动相，色谱柱为Agilent EC C18，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低，5.0 min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。在一种优选方案中，色谱柱的长度为50mm，直径为3.0mm，填料粒径为2.7μm。例如，色谱柱为Agilent EC C18（2.7μm, 3.0mm*50mm）。
[0011]为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本专利技术在流动相A中添加了甲酸，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC
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MS/MS方法检测水溶性维生素的方法，仅仅采用蛋白沉淀和衍生化前处理的方法，衍生化反应简单，灵敏度更高，样本用量小，特异性强、成本低，5分钟之内可同时检测3种水溶性维生素。在不影响本专利技术效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.05~0.15%甲酸水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1%甲酸水溶液。
[0012]在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本专利技术分别采用维生素B7（VB7）、维生素B9（VB9）和烟酸（NA）作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中水溶性维生素时的重现性、准确度均较好。
[0013]在一种优选方案中，流速为0.2~0.5 mL/min，优选为0.4 mL/min。
[0014]进一步地，柱温为35~45℃，优选为40℃。
[0015]进一步地，进样体积为1~10
ꢀµ
L，优选为2
µ
L。
[0016]在一种优选方案中，采用甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，具体色谱条件为：
（1）超高效液相色谱条件：流动相A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：甲醇；色谱柱为：AgilentECC18（2.7μm，3.0mm*50mm）；采用流动相A和流动相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，所述水溶性维生素分别为：维生素B7、维生素B9和烟酸；上述水溶性维生素对应的同位素内标物分别为：维生素B7
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d4、维生素B9
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d4和烟酸
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d4；采用高效液相色谱串联质谱检测经过预处理的血清中的水溶性维生素，利用高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再通过质谱仪检测目标待测物与其对应同位素内标的质荷比的响应，使用同位素内标法定量，分别计算出3种水溶性维生素的含量，具体色谱条件为：（1）高效液相色谱条件：流动相A：0.01~0.5%甲酸水溶液；流动相B：甲醇；色谱柱为：Agilent EC C18；采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱，所述梯度洗脱过程如下：在0
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1.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由80:20匀速渐变至30:70；在1.0
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2.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由30:70匀速渐变至2:98；在2.5
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3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为2:98；在3.0
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3.1分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98匀速渐变至80:20；在3.1
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5.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比为80:20；（2）质谱条件：在电喷雾电离模式下，采用多反应监测进行正负切换扫描；毛细管电压为3.5kV，喷嘴电压为100 V；干燥气温度为300℃，鞘气温度为325℃，干燥气流速为7 L/min，鞘气流速为11 L/min，雾化气压力30 psi；同时监测3种水溶性维生素及其对应同位素内标。2.根据权利要求1所述的甲基衍生化
‑
高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，其特征在于，所述经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清加入混合内标工作液，涡旋后加入蛋白沉淀剂，振荡离心后取上清液经氮气吹干，向其中加入衍生化试剂，在避光的条件下于40
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80℃进行衍生反应10
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60 min，所得反应液冷却至室温，加入氨水溶液进行中和，再次振荡离心后，取上清液待进样。3.根据权利要求2所述的甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，其特征在于，所述蛋白质沉淀剂为甲醇或乙腈；所述衍生化试剂为盐酸与甲醇的混合溶液；所述氨水溶液为40~80%氨水溶液。4.根据权利要求3所述的甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，其特征在于，所述蛋白质沉淀剂为甲醇；所述衍生化试剂为体积比为1:4~10的盐酸与甲醇的混合溶液；所述氨水溶液为50%氨水溶液。5.根据权利要求4所述的甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，其特征在于，所述衍生化试剂为体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液。6.根据权利要求5所述的甲基衍生化
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高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，其特征在于，所述经过预处理的血清按照如下方法制备：取50 μL血清于1.5 mL离心管中，向其中加入20 μL混合内标工作液，涡旋后，加入180
ꢀµ
L甲醇，振荡后，在转速为1400~15000 r/min，4℃的条件下离心4~10min；取150
ꢀµ
L上清液在37℃氮气下吹干，向其中加入100
ꢀµ
L体积比为1:9的盐酸与甲醇的混合溶液，涡旋混匀后，在避光的条件下于50℃进行衍生反应20 min，所得反应液冷却至室温，加入20
ꢀµ
L 50%氨水进行中和，再次振荡后，在
转速为1400~15000 r/min，4℃的条件下离心1~5min，取上清液待进样。7.根据权利要求6所述的甲基衍生化
‑
高效液相色谱串联质谱检测血清中水溶性维生素的方法，其特征在于，所述混合内标工作液按照如下方法制备：称取各同位素内标物，维生素B7
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d4、维生素B9
...

【专利技术属性】
技术研发人员：成晓亮，周亚飞，李美娟，
申请(专利权)人：南京品生医疗科技有限公司上海氨探生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：