一种温控基因表达纳米材料的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及温控基因表达纳米材料的制备方法及其应用，可有效解决通过精准控温，避免过高热对被转染细胞及周围组织造成的损伤，实现基因工程的非破坏性光热激活的问题，制备方法是，壳聚糖溶于醋酸去离子水溶液中，制成溶液A；将EDC和对茴香酸加入到DCM中，加入NHS，在室温氩气下搅拌，干燥，再加入巯基

【技术实现步骤摘要】
一种温控基因表达纳米材料的制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及医药领域，特别是一种温控基因表达纳米材料的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]转基因系统是将遗传物质或基因编辑装置带入细胞内以持续产生治疗性蛋白质或纠正细胞错误基因的核酸，为调节细胞行为提供有用工具，并有可能导致创新疗法。近年来，通过病毒或非病毒载体将外源核酸递送到特定细胞中的基因疗法已成为一种有前途的治疗方法来治疗遗传性疾病和癌症。然而，在非特定部位的表达不仅降低治疗效率也可能会导致不可逆的副作用，从而限制了它们的临床应用。
[0003]在基因治疗中，编码特异性启动子是一种可行的解决方案，其中光由于其低毒性、易调节和高时空分辨率，是理想的基因表达诱导剂。其中光热转换材料在激光照射下可以产生热，刺激热冲击因子（HSF）从单体向三聚体的转变，然后HSF三聚体易位到细胞核，与HSP70中的热休克元件（HSE）结合并激活转录，可以实现在指定的位置和时间精准调控基因表达。此外，热可以增加细胞膜的通透性，以提高细胞的摄取和基因转染效率。近年来，无机材料和近红外染料已被应用于热启动基因治疗。然而，在激光照射过程中，温度很难被精确控制。过高温不可避免地损害被转染的细胞，影响基因表达效率，并对周围正常组织造成不可逆的损伤。因此，迫切需要开发精准温控基因表达系统以实现无损伤光热激活基因表达来提高基因治疗效率和安全性。目前，未见通过温和恒温转基因系统来实现安全无损启动基因表达的方法的报导。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术目的就是提供一种温控基因表达纳米材料的制备方法及其应用，可有效解决通过精准控温，避免过高热对被转染细胞及周围组织造成的损伤，实现基因工程的非破坏性光热激活的问题。
[0005]本专利技术解决的技术方案是，一种温控基因表达纳米材料的制备方法及，包括以下步骤：1）将壳聚糖（CS）溶于体积浓度1%醋酸去离子水溶液20mL中，使壳聚糖浓度为5～10mg/mL，300rpm搅拌8
‑
12h过夜，制成溶液A；2）将1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）1.6
‑
2.2g和对茴香酸0.8
‑
1.2g加入到二氯甲烷（DCM）250 mL中，然后加入N
‑
羟基琥珀酰亚胺（NHS）0.8
‑
1.3 g，混匀，在室温氩气下搅拌42h，干燥，得到NHS活化的氨基乙基茴香酰胺（AEAA
‑
NHS）；将浓度为0.034mmol的NHS活化的氨基乙基茴香酰胺（AEAA
‑
NHS）1.8
‑
2.2mL与巯基
‑
聚乙二醇
‑
羧基（SH
‑
PEG
‑
COOH）90
‑
110mg在N2保护下反应48h，合成羧基化聚乙二醇接枝的氨基乙基茴香酰胺（AEAA
‑
PEG
‑
COOH）；将N
‑
羟基琥珀酰亚胺（NHS）5.5
‑
6.0mg和1
‑
乙基
‑3‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）19.0
‑
19.3mg加入溶液A中，搅拌1h，再加入羧基化聚乙二醇接枝的氨基乙基茴
香酰胺（AEAA
‑
PEG
‑
COOH），将反应混合物在室温下搅拌8～12h过夜；收集该混合物溶液，用MWCO=8000～14000的透析袋在去离子水中透析46～50h，将透析液冷冻干燥46～50h，得到粉末B；3）将热敏绿、β
‑
萘酚、聚乙二醇的混合物320
‑
340mg通过红外加热炉90
‑
110W加热4～6min，得到透明的熔融物，然后加入丙酮溶解，成溶液C；所述的热敏绿、β
‑
萘酚、聚乙二醇的质量比为1︰5︰60；4）将溶液C在搅拌下滴加到粉末B中，搅拌2min，形成均匀的绿色溶液，50kDa超滤管离心，去除杂质，得到纳米材料D；将纳米材料D中的热敏绿与表达共刺激分子CD86或CD80的质粒以质量比1～10︰1反应30min，离心，除去未吸附上的质粒，得温控基因表达纳米材料，粒径为100～150nm。
[0006]所述的壳聚糖分子量为5kDa，15kDa，25kDa，100kDa中的一种或两种以上的混合物。
[0007]所述的聚乙二醇的分子量为1000、1500、2000、4000中的一种或两种以上的混合物。
[0008]所述方法制备的温控基因表达纳米材料在制备基因治疗药物中的应用，所述的基因治疗药物为DNA药物和RNA药物。
[0009]本专利技术将以肿瘤相关成纤维细胞为例（CAFs），CAFs是实体肿瘤微环境中最丰富的基质成分之一，积累的证据表明，CAFs可以直接使CD8细胞毒性T淋巴细胞失去功能。然而，目前抗CAFs介导的免疫抑制的尝试主要集中在靶向CAFs的清除，其临床转化可能受到清除效率有限和潜在的肿瘤转移风险等因素的阻碍。考虑到CAFs在癌症进展中的双重作用（免疫抑制和维持肿瘤组织稳态），本专利技术利用精准温控基因表达纳米材料原位安全地将免疫抑制的CAFs重编程为免疫激活的抗原呈递细胞，与目前的CAFs消除技术不同，本专利技术既放大了免疫治疗，又避免了因破坏肿瘤组织稳态而引起的转移风险。
[0010]本专利技术制得的精准温控基因表达纳米材料可精准启动多种被转染细胞的基因表达，所述转染细胞包括CAF细胞，4T1细胞，B16F10细胞，NIH3T3细胞，L929细胞，293细胞。
附图说明
[0011]图1为本专利技术温控基因表达纳米材料的电位与粒径分析图；图2为本专利技术温控基因表达纳米材料的透射电镜图；图3为本专利技术温控基因表达纳米材料的光热效应图；图4为本专利技术温控基因表达纳米材料被循环激光照射后的光热转换稳定性图；图5为本专利技术温控基因表达纳米材料在不同热敏绿/质粒重量比下的琼脂糖凝胶电泳图（T作为TNP@CS
‑
A中热敏绿的代表）；图6为本专利技术温控基因表达纳米材料保护DNA免受DNase I降解的琼脂糖凝胶位移图；图7为本专利技术温控基因表达纳米材料在血清中的稳定性图；图8为本专利技术温控基因表达纳米材料不同浓度对CAFs细胞活力的影响图；图9为本专利技术温控基因表达纳米材料在有无激光照射下对CAFs细胞活力的影响图（激光（+）或无激光照射（
−
））；
图10为本专利技术温控基因表达纳米材料在活/死细胞染色实验中对CAFs细胞活力的影响图；图11为本专利技术温控基因表达纳米材料转染CAFs后基因的表达图。
具体实施方式
[0012]以下结合附图和实施例对本专利技术的具体实施方式作详细说明。
[0013]本专利技术在具体实施中可由以本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种温控基因表达纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将壳聚糖溶于体积浓度1%醋酸去离子水溶液20mL中，使壳聚糖浓度为5～10mg/mL，300rpm搅拌8
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12h过夜，制成溶液A；2）将1
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乙基
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐1.6
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2.2g和对茴香酸0.8
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1.2g加入到二氯甲烷250mL中，然后加入N
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羟基琥珀酰亚胺0.8
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1.3g，混匀，在室温氩气下搅拌42h，干燥，得到NHS活化的氨基乙基茴香酰胺；将浓度为0.034mmol的NHS活化的氨基乙基茴香酰胺1.8
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2.2mL与巯基
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聚乙二醇
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羧基90
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110mg在N2保护下反应48h，合成羧基化聚乙二醇接枝的氨基乙基茴香酰胺；将N
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羟基琥珀酰亚胺5.5
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6.0mg和1
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乙基
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐19.0
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19.3mg加入溶液A中，搅拌1h，再加入羧基化聚乙二醇接枝的氨基乙基茴香酰胺，将反应混合物在室温下搅拌8～12h过夜；收集该混合物溶液，用MWCO=8000～14000的透析袋在去离子水中透析46～50h，将透析液冷冻干燥46～50h，得到粉末B；3）将热敏绿、β
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萘酚、聚乙二醇的混合物320
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340mg通过红外加热炉90
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110W加热4～6min，得到透明的熔融物，然后加入丙酮溶解，成溶液C；所述的热敏绿、β
‑
萘酚、聚乙二醇的质量比为1︰5︰60；4）将溶液C在搅拌下滴加到粉末B中，搅拌2min，形成均匀的绿色溶液，50kDa超滤管离心，去除杂质，得到纳米材料D；将纳米材料D中的热敏绿与表达共刺激分子CD86或CD80的质粒以质量比1～10︰1反应30min，离心，除去未吸附上的质粒，得温控基因表达纳米材料，粒径为100～150nm。2.根据权利要求1所述的温控基因表达纳米材料的制备方法，其特征在于，所述的壳聚糖分子量为5kDa，15kDa，25kDa，100kDa中的一种或两种以上的混合物。3.根据权利要求1所述的温控基因表达纳米材料的制备方法，其特征在于，所述的聚乙二醇的分子量为1000、1500、2000、4000中的一种或两种以上的混合物。4.根据权利要求1所述的温控基因表达纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）将壳聚糖100mg溶于体积浓度1%醋酸去离子水溶液20mL中，300rpm搅拌8
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12h过夜，制成溶液A；2）将1
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乙基
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐1.9g与对茴香酸1.0g加入到二氯甲烷250mL中，然后加入N
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羟基琥珀酰亚胺1.1g，混匀，在室温氩气下搅拌42h，干燥，得到NHS活化的氨基乙基茴香酰胺；将浓度为0.034mmol的NHS活化的氨基乙基茴香酰胺2mL与巯基
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聚乙二醇
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羧基100mg在N2保护下反应48h，合成羧基化聚乙二醇接枝的氨基乙基茴香酰胺；将N
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羟基琥珀酰亚胺5.75mg和1
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乙基
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(3
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二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐19.17mg加入溶液A中，搅拌1h，再加入羧基化聚乙二醇接枝的氨基乙基茴香酰胺，将反应混合物在室温下搅拌10h过夜；收集该混合物溶液，用MWCO=10000的透析袋在去离子水中透析48h，将透析液冷冻干燥48h，得到粉末B；3）将热敏绿、β
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萘酚、聚乙二醇的混合物330mg通过红外加热炉100W加热5min，得到透明的熔融物，然后加入丙酮溶解，成溶液C；4）将溶液C在搅拌下滴加到粉末B中，搅拌2min，形成均匀的绿色溶液，50kDa超滤管离
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【专利技术属性】
技术研发人员：刘军杰，耿世珍，史进进，郭鹏克，张云雅，向婷婷，时雅茹，王静，李新灵，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：