一种杂交捕获方法及试剂盒技术

一种杂交捕获方法及试剂盒，该方法包括：一次杂交步骤，包括将测序文库与探针混合，反应得到一次杂交产物；二次杂交步骤，将所述一次杂交产物与探针混合，反应得到二次杂交产物；二次杂交的反应程序包括变性、退火、降温、温浴，热循环的程序包括：先对杂交反应体系从退火温度进行降温，然后升温至温浴温度。本发明专利技术的杂交方法在超小区域捕获测试中可以将捕获效率从4％左右提高到90％左右。获效率从4％左右提高到90％左右。获效率从4％左右提高到90％左右。

【技术实现步骤摘要】
一种杂交捕获方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因组学领域，具体涉及一种杂交捕获方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]1.NGS和探针捕获技术
[0003]高通量测序技术(High
‑
throughput sequencing)又称“下一代”测序技术(“Next
‑
generation”sequencing technology)简称“NGS”，以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。
[0004]目标序列捕获测序，是将感兴趣的基因组区域定制成特异性探针与基因组DNA进行杂交(固相或液相)，将目标基因组区域的DNA片段进行富集后再利用第二代测序技术进行测序。这种新的方法与PCR方法相比，通量高，同时能节省大量的时间及成本。
[0005]目前市场上常用的探针分为DNA探针和RNA探针两大类型，RNA探针是单链RNA片段，通过与目标文库分子杂交来富集目标区域DNA；DNA探针则是由单链DNA片段构成，同样是通过与目标文库分子杂交来富集目标区域DNA。
[0006]2.超高深度测序与MRD检测
[0007]由于测序成本逐年降低，在不同时代对于什么是超高深度测序的定义一直在变，最近在2021年发布的《非小细胞肺癌分子残留病灶专家共识》中规定MRD(Minimal Residual Disease，微小残留病灶)检测基本技术标准是可稳定检测出丰度≥0.02％的ctDNA，因此对于MRD检测应用来说至少需要原始测序深度在100000
×
以上才有可能达到这一检测限。对于现有技术来说，为了达成这一目标，panel(捕获探针)设计区域更小、个性化突变位点选择更加精准是未来发展的必然趋势，但同样panel区域小于30kb后在杂交捕获中会带来一些新的问题，如捕获率低、杂交产量低等。目前市场上已经推出了MRD产品。且原始测序深度在100000
×
以上的公司为了避免这些问题，均采用了多重PCR的检测方式，然而多重PCR则会面临无法计算得到准确的ctDNA含量的问题。

技术实现思路

[0008]根据第一方面，在一实施例中，提供一种杂交捕获方法，包括：
[0009]一次杂交步骤，包括将测序文库与探针混合，反应得到一次杂交产物；
[0010]二次杂交步骤，将所述一次杂交产物与探针混合，反应得到二次杂交产物；
[0011]二次杂交的反应程序包括变性、退火、降温、温浴，热循环的程序包括：先对杂交反应体系从退火温度进行降温，然后升温至温浴温度。
[0012]根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包括杂交组合物，所述杂交组合物含有金属盐、螯合剂中的至少一种。
[0013]依据上述实施例的一种杂交捕获方法及试剂盒，本专利技术的杂交方法在超小区域捕获测试中可以将捕获效率从4％左右提高到90％左右。
[0014]在一实施例中，基于热循环杂交的二次捕获最短可以在一小时内完成杂交捕获，
且测序数据结果显示依然可以维持高捕获效率。
[0015]在一实施例中，本专利技术提供的杂交方法在更少的数据量下可以达到比常规杂交更高的有效测序深度。
附图说明
[0016]图1为一种实施例的超小区域DNA探针杂交捕获建库流程示意图；
[0017]图2为一种实施例的热循环杂交原理示意图；
[0018]图3为文库片段长度分布图；
[0019]图4为捕获均一性结果图；
[0020]图5为热点覆盖结果图。
具体实施方式
[0021]下面通过具体实施方式结合附图对本专利技术作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
[0022]另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
[0023]本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
[0024]目前常见的DNA探针捕获很少涉及30kb以下的超小区域杂交，通常在小于30kb的杂交中会出现杂交捕获效率大幅降低或者不稳定的现象。然而对于一些特殊的应用场景来说(比如MRD检测)，需要极高的测序深度来实现一些频率极低的突变检测，就需要对特定的超小区域进行杂交捕获。因此，本专利技术特别对这种超小区域的DNA探针杂交捕获方法进行了设计，形成了一套可以提高捕获效率的方法。
[0025]在一实施例中，本专利技术依然采用了定制化panel捕获这一方式进行MRD检测，虽然检测成本更高，但由于可以通过UMI还原到建库前的原始DNA模板，所以检测结果更加精准且更加可控。
[0026]根据第一方面，在一实施例中，提供一种杂交捕获方法，包括：
[0027]一次杂交步骤，包括将测序文库与探针混合，反应得到一次杂交产物；
[0028]二次杂交步骤，将所述一次杂交产物与探针混合，反应得到二次杂交产物；
[0029]二次杂交的反应程序包括变性、退火、降温、温浴，热循环的程序包括：先对杂交反应体系从退火温度进行降温，然后升温至温浴温度。从退火温度降温，然后升温至温浴温度的过程亦称热循环。一次杂交步骤采用常规方法。通过瞬时的升降温来实现PCR管内液体分
子的热交换运动，从而达到扩大DNA文库分子和探针分子布朗运动范围的效果，以此来实现低浓度探针投入情况下的高特异性分子杂交效果。
[0030]在一实施例中，二次杂交步骤中，降温时，将杂交反应体系降温至30～55℃，优选为30～40℃，更优选为35～38℃。还可以降温至37～55℃。
[0031]在一实施例中，二次杂交步骤中，将杂交反应体系降温至30～55℃后，保持1～5s。
[0032]在一实施例中，二次杂交步骤中，退火后，先升温，再降温。该升温步骤可提高捕获效率。该升温步骤是非必需的，如果探针杂交特异性足够高，也可以在退火后直接进行降温，不进行前述升温步骤。
[0033]在一实施例中，二次杂交步骤中，退火后，先升温至65～68℃，再降温。
[0034]在一实施例中，二次杂交步骤中，退火后，先升温至65～68℃，保持1～5s，再降温。
[0035]在一实施例中，二次杂交步骤中，温浴温度为6本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种杂交捕获方法，其特征在于，包括：一次杂交步骤，包括将测序文库与探针混合，反应得到一次杂交产物；二次杂交步骤，将所述一次杂交产物与探针混合，反应得到二次杂交产物；二次杂交的反应程序包括变性、退火、降温、温浴，热循环的程序包括：先对杂交反应体系从退火温度进行降温，然后升温至温浴温度。2.如权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，二次杂交步骤中，降温时，将杂交反应体系降温至30～55℃；优选地，二次杂交步骤中，降温时间为1～5s。3.如权利要求1～2任意一项所述的杂交捕获方法，其特征在于，二次杂交步骤中，退火后，先升温，再降温；优选地，二次杂交步骤中，退火后，先升温至65～68℃，再降温；优选地，二次杂交步骤中，退火后，先升温至65～68℃，保持1～5s，再降温。4.如权利要求1所述的杂交捕获方法，其特征在于，二次杂交步骤中，杂交反应体系中加有杂交组合物，所述杂交组合物含有金属盐、螯合剂中的至少一种。5.如权利要求4所述的杂交捕获方法，其特征在于，二次杂交步骤中，所述杂交组合物含有金属盐以及螯合剂。6.如权利要求4或5所述的杂交捕获方法，其特征在于，二次杂交步骤中，所述金属盐包括氯化钠、氯化钾、氯化铵、氯化镁、氯化锰中的至少一种；优选地，所述螯合剂包括乙二胺四乙酸。7.如权利要求4所述的杂交捕获方法，其特征在于，所述杂交组合物还含有缓冲液；优选地，所述缓冲液包括Tris
‑
HCI缓冲液；优选地，所述杂交组合物的pH为7.0～8.0；优选地，所述杂交组合物还含有水；优选地，所述杂交组合物中，金属盐的浓度为58.5μg/μL；优选地，所述杂交组合物中，螯合剂的浓度为0.375μg/μL；优选地，所述杂交组合物中，缓冲液的体积占杂交试剂总体积的1％...

【专利技术属性】
技术研发人员：于源，叶睿，廖信辉，李暾，王鹏，李淼，李艳，王光杓，吴东方，高志博，
申请(专利权)人：深圳裕康医学检验实验室，
类型：发明
国别省市：