一种表达PCNP基因的药物在抗流感病毒中的应用制造技术

本发明专利技术属于基因药物领域，尤其涉及一种表达PCNP基因的药物在抗流感病毒中的应用。本发明专利技术还提供了PCNP核蛋白的制备方法和其抗流感病毒活性，本研究利用杆状病毒表达系统表达核蛋白PCNP蛋白并进行了WB验证，小鼠实验证明该蛋白能够提高对H1N1和H3N2病毒的攻毒保护效率，可以用于治疗或预防不同亚型流感病毒的感染。本发明专利技术的核蛋白PCNP的制备方法简单、成本低、治疗效果好，可以用于流感病毒的预防及治疗，为防控流感病毒的流行提供帮助。为防控流感病毒的流行提供帮助。为防控流感病毒的流行提供帮助。

【技术实现步骤摘要】
一种表达PCNP基因的药物在抗流感病毒中的应用


[0001]本专利技术属于基因药物领域，尤其涉及一种过表达PCNP基因的药物在在抗流感病毒中的应用。

技术介绍

[0002]PCNP(PEST
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containing nuclear protein)，一种新近发现的含有PEST序列的核蛋白，PCNP作为泛素连接酶NIRF(Np95/ICBP90
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like RING figer protein)的底物首次于2004年由日本科学家侧面报道，PCNP和NIRF一起构成一种新的信号转导通路，与细胞周期的调控和细胞增殖有密切关系。PCNP主要存在细胞核内，这种新型的指环状蛋白是一种具有泛素化能力的蛋白连接酶，参与到蛋白降解的泛素化途径中。目前，关于PCNP的相关报道较少，但关于PEST结构域的研究相对较多，PEST对于细胞周期和增殖具有调控作用，并且和染色体的稳定、肿瘤的发生以及免疫系统疾病有关。
[0003]流感是有流感病毒引起的全球性的严重传染病之一，每次流感的爆发都会给社会经济和人类健康带来巨大的损害。甲型流感病毒是属正黏科病毒，宿主范围广，包括人类、哺乳动物和禽类，可引发季节性流感和禽流感。H1N1和H3N2作为其代表病毒之一，参与了多次流感的爆发，给人们的生活造成了巨大的不变。
[0004]PCNP作为一种与免疫系统有关的疾病基因，有报道显示其能够抑制人肝癌细胞和人神经母细胞瘤的生长，我们尝试其在抗流感方面的应用，通过杆状病毒表达系统表达蛋白，并进行免疫保护实验，验证了PCNP能否保护流感病毒的攻击。

技术实现思路

[0005]为了解决本专利技术的技术问题，本专利技术提供一种过表达PCNP基因的药物在抗流感病毒中的应用。所述药物通过将PCNP基因克隆到杆状病毒表达载体，通过杆状病毒表达系统表达蛋白PCNP，然后通过小鼠攻毒保护实验验证PCNP抗流感活性。
[0006]为了达到本专利技术的目的，本专利技术所述表达PCNP基因的药物通过杆状病毒表达系统表达PCNP核蛋白步骤如下：提取小鼠肺组织中RNA后反转录为cDNA，用PCNP核蛋白的引物以cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCNP的基因片段；将PCNP基因克隆至pFastBac1载体，转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒，用该病毒接种昆虫细胞后，表达纯化，得到所述蛋白。
[0007]具体的，所述PCNP核蛋白的引物的序列为：
[0008]F:CCCGGAATTCATGGTTGTTGGGCGGGGTCGTGACGTCCTTGGCGTGGCT(SEQ ID NO:1)；
[0009]R:CCCAAGCTTTTAGTGATGATGGTGGTGATGATTGTCTTGGTCATGGACAT(SEQ ID NO:2)。
[0010]所述PCNP基因和pFastBac1载体酶切的限制性内切酶为EcoRI和HindIII。
[0011]所述纯化的方式为使用镍柱亲和层析的方式。
[0012]所述的表达PCNP基因的药物的制备方法，包括以下步骤：
[0013]步骤一、重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将得到的PCNP基因与pFastBac1载体的基因进行多克隆位点分析，选择载体上提供而目的片段中没有的两个限制性内切酶：EcoRI
和HindIII，双酶切后将回收目的片段插入到昆虫细胞表达载体pFastBac1中，转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞。
[0014]步骤二、重组杆状病毒的拯救：用重组杆状病毒Bacmid质粒转染昆虫细胞，拯救获得重组杆状病毒。
[0015]步骤三、蛋白的大量表达及纯化：将获得的重组杆状病毒按MOI＝3感染昆虫细胞，3天后收获上清，将获得的上清通过镍柱亲和层析的方式纯化，即可得到PCNP核蛋白。
[0016]所述步骤一具体操作为：分别取1μl pFastBac1
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PCNP加入到50μl DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激45s，冰浴2min加入1ml无抗性的LB培养基，37℃培养48h，挑取白斑菌落，加入LB培养基,37℃200rpm/min摇床培养12h，提取质粒DNA进行PCR鉴定，鉴定正确的阳性质粒即为重组杆状病毒Bacmid质粒。
[0017]所述步骤二中待昆虫细胞的细胞汇合达到80％以上时进行转染。
[0018]所述步骤二、三中使用的昆虫细胞为Sf9细胞。
[0019]所述步骤三中的纯化操作方法为将上清加入到镍柱中使其充分结合，然后用25mmol浓度的咪唑冲洗，再用250mmol的咪唑洗脱。
[0020]本专利技术所述的PCNP蛋白可以作为过表达PCNP基因药物在抗流感方面的应用。
[0021]本专利技术的显著技术效果。
[0022]本课题组采用的杆状病毒表达系统本身的表达量高产品活性好，另外我们在原始基因的基础上进行针对性的序列优化后可以使表达量更进一步的提升，该方法具有大量生产的优势，产量高，可以有效降低其生产成本，并且对H1N1和H3N2流感病毒的攻击有良好的保护效果。
附图说明
[0023]图1为pFastBac1
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PCNP质粒转染sF9细胞后，对P3代细胞进行SDS
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PAGE验证，图中可以看到PCNP蛋白的表达。
[0024]图2为PCNP蛋白镍柱纯化过程中，细胞原液、流传液、洗脱液各组分的蛋白情况；其中1.Marker、2.细胞裂解液、3.流穿液、4.25mM咪唑洗涤液、5.50mM咪唑洗涤液、6.100mM咪唑洗涤液、7.100mM咪唑洗涤液、8.250mM咪唑洗涤液。
[0025]图3为PCNP蛋白镍柱纯化后，可以得到纯净的PCNP蛋白；其中1.Marker、2.透析后的PCNP蛋白、3.透析后的PCNP蛋白。
[0026]图4为针对H1N1流感病毒(mouse
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adapted A/Changchun/01/2009)和H3N2病毒的攻击(mouse
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adapted A/baikal teal/Shanghai/SH
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89/2013)后小鼠的生存率和体重变化率。A和B分别为H1N1攻毒后小鼠体重变化(A)和生存率变化(B)，C和D分别为H3N2攻毒后小鼠体重变化(C)和生存率变化(D)。
[0027]具体实施方法
[0028]下面结合附图及具体实施方式对本专利技术技术方案做进一步详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0029]实施例1PCNP核蛋白的表达及鉴定
[0030]1材料：E.coli DH5α和E.coli DH10Bac由本实验室保存，供体质粒pFastBac1购自
Invitrogen公司，昆虫细胞转染试剂盒购自Invitrogen公司，核酸内切酶购自Thermo公司，基因组提取试剂盒购自AX本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.表达PCNP基因的药物在抗流感药物方面的应用。2.如权利要求1所述的过表达PCNP基因的药物在抗流感药物方面的应用，其特征在于，所述PCNP基因通过杆状病毒表达系统表达得到PCNP核蛋白，具体步骤如下：提取小鼠肺组织中RNA后反转录为cDNA，用PCNP核蛋白的引物以cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCNP的基因片段；将PCNP基因克隆至pFastBac1载体，转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒，用该病毒接种昆虫细胞后，表达纯化得到所述蛋白。3.如权利要求1所述的过表达PCNP基因的药物在抗流感药物方面的应用，其特征在于，所述PCNP核蛋白的引物的序列为：F:CCCGGAATTCATGGTTGTTGGGCGGGGTCGTGACGTCCTTGGCGTGGCT(SEQ ID NO:1)；R:CCCAAGCTTTTAGTGATGATGGTGGTGATGATTGTCTTGGTCATGGACAT(SEQ ID NO:2)。4.如权利要求1所述的过表达PCNP基因的药物B在抗流感药物方面的应用，其特征在于，所述的PCNP基因和pFastBac1载体酶切的限制性内切酶为EcoRI和HindIII；所述纯化的方式为使用镍柱亲和层析的方式。5.如权利要求1所述的过表达PCNP基因的药物在抗流感药物方面的应用，其特征在于，所述的表达PCNP基因的药物的制备方法，包括以下步骤：步骤一、重组杆状病毒Bacmid质粒的构建：将得到的PCNP基因与pFastBac1载体的基因进行多克隆位点分析，选择载体上提供而目的片段中没有的两个限制性...

【专利技术属性】
技术研发人员：高玉伟，任志广，杨争艳，吴东栋，王铁成，冯娜，赵永坤，李元果，孙伟洋，窦悦，刘夏薇，杨松涛，夏咸柱，姬新颖，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：