一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增RAA引物探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增RAA引物探针组合及其应用，所述引物探针组合的扩增效率高、特异性强且无明显的假阳性，此外，其能够将耳念珠菌与临床微生物鉴定系统中常常误诊的三种近缘菌有效区分开，本发明专利技术基于RAA

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增RAA引物探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于病原微生物检测
，具体涉及一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增RAA引物探针组合及其应用。

技术介绍

[0002]耳念珠菌(Candida auris)是于2009年在一名日本患者的外耳道分泌物中首次发现的病原真菌，至今为止，耳念珠菌已经在除南极洲以外其他六大洲的40多个国家被报道。耳念珠菌感染可以发生在各个年龄段的人群，其中，在老年人中最为常见，新生儿和儿童也偶有感染。耳念珠菌常见的宿主可以分为三类：一是患有严重免疫缺陷疾病或自身免疫能力较弱的人群，二是开放性手术患者或侵入性导管使用患者，三是使用广谱抗菌药物治疗的人群。该真菌主要引起持续性、侵袭性感染，对氟康唑等常用抗真菌药物呈多重耐药性，感染患者的病死率高达30％
‑
60％，可快速播散并能引起医院感染的暴发流行，故被称为“超级真菌”。耳念珠菌作为一种新出现的多重耐药的酵母菌，具有较大的基因组多样性、多重耐药性和高致死亡率，其极易传播并感染院内患者，从而造成医院内爆发式感染，且感染多见于念珠菌血症。由于目前常见的表型鉴定及微生物鉴定系统均无法准确鉴定耳念珠菌，因此，常导致临床微生物学实验室对该菌株的鉴定错误，进而导致误诊，为临床上及时预防和控制耳念株菌的传播带来了极大困难。
[0003]病原体的准确鉴定是任何传染病治疗的前提条件，及时准确的诊断才能保证实施最快的合理治疗，并有效控制进一步传染的风险，从而降低传染性疾病在环境中爆发的机会。耳念珠菌在表型及生理生化方面与其他念珠菌具有普遍的相似性，因此导致其在临床诊断过程中容易被误诊。因此该真菌感染的诊断需要使用相对特殊的生化检测或分子生物学检测手段，例如，基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(matrix
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assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI
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TOF MS)检测特异性蛋白或基于核糖体内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)及28S rDNA(ribosomal DNA)D1/D2区的序列分析鉴定。其中，虽然MALDI
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TOF MS可用于鉴定耳念珠菌，但是该方法依赖于数据库的更新，并非所有的MALDI
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TOF MS设备都可以用于耳念珠菌的检测，并且其必须基于纯培养物，可用于菌株特异性鉴定的蛋白质种类有限，因此在实际应用中往往受到限制。此外，上述用于耳念珠菌鉴别诊断的方法均需要配合相应的仪器使用，通常需要高成本的额外设备和经过专业培训的技术人员，鉴定成本高，很多医疗机构难以负担。
[0004]此外，常规真菌鉴定手段，包括念珠菌显色培养基和微生物商业检测系统，不仅耗时费力，而且阳性率低、错误率高。其中，最常用的临床微生物鉴定系统，例如VITEK2、API
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20CAUX和BD酵母鉴定系统经常将耳念珠菌误诊为其他近缘念珠菌如C.haemulonii、C.duobushaemulonii、C.pseudohaemulonii、C.guilliermondii、C.parapsilosis等，导致耳念珠菌感染患者漏诊、误诊率极高。韩国于2011年报告3例由耳念珠菌引起的医院内真菌
感染，同时该研究表明耳念珠菌通常被VITEK和API
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20C AUX等商业鉴定系统错误地鉴定为希木龙念珠菌和黏红酵母菌。印度的一项综合研究经ITS测序证实，先前用VITEK系统鉴定为希木龙念珠菌或无名假丝酵母菌的102株菌株中有90株应为耳念珠菌，错误鉴定的比例高达88.2％。可见现有的诊断工具成本高、准确度低，可能导致耳念珠菌以及其近缘种的发病率在全球范围内被低估，尤其是医疗资源受限地区(如非洲和东南亚)。这也一定意义上解释了现有的爆发流行以及感染个案均来自于发达国家(如美国，英国和德国)或低收入地区的医疗发达城市(如新德里，印度)的原因。
[0005]等温核酸扩增技术是近年来新发展起来的一类分子生物学技术的总称。其可在特定温度下扩增特定的DNA或RNA。无论是在实际操作还是仪器要求方面，都比PCR技术更为简单方便，它摆脱了对精良设备的依赖，反应时间大大缩短，在临床和现场快速诊断中显示出了良好的应用前景。目前已开发出了多种等温扩增方法，如依赖核酸序列扩增(Nucleic acid sequence
‑
based amplification，NASBA)、链替代扩增(Strand displacement amplification，SDA)、环介导等温扩增技术(Loop
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mediated isothermal amplification，LAMP)、解链酶扩增(Helicase
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dependent amplification，HAD)、重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)、重组酶介导的等温扩增技术(Recombinase aided amplification，RAA)、转录依赖的扩增系统(Transcription
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based Amplification System，TAS)、滚环扩增(Rolling circleamplification，RCA)等。其中，RAA是一种新型核酸恒温扩增技术，能够在20分钟内进行常温下的单分子核酸检测。其不依赖于昂贵的实验室设备和专业操作人员，对于在经济卫生条件不发达的地区以及疾病爆发现场开展耳念珠菌的监测和鉴定工作具有重要的意义和良好的应用前景。然而，目前尚未见RAA技术用于耳念珠菌检测的相关报道，更无合适高效的RAA引物探针组能够用于耳念珠菌的检测。
[0006]因此，如何克服现有技术存在的上述不足，建立一种特异性高、准确、灵敏、快速、方便、成本低廉的耳念珠菌检测方法是目前本领域亟需解决的技术问题之一。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的在于提供一种用于检测耳念珠菌的恒温核酸扩增RAA引物探针组合及其应用。
[0008]本专利技术的上述目的通过以下技术方案得以实现：
[0009]本专利技术的第一方面提供了一种用于耳念珠菌检测的恒温核酸扩增RAA引物探针组合。
[0010]进一步，所述引物探针组合包括上游引物、下游引物和探针；
[0011]所述上游引物的核苷酸序列为F10
’‑
1：5
’‑
AAGGATCATTATTGATATTTTGCATACACA
‑3’
；
[0012]所述下游引物的核苷酸序列为R10
’
：5
’‑
Biotin
‑
TTCAAAGATTCGATGATTCACGTCTGCAAG
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于耳念珠菌检测的恒温核酸扩增RAA引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列为F10
’‑
1：5
’‑
AAGGATCATTATTGATATTTTGCATACACA
‑3’
；所述下游引物的核苷酸序列为R10
’
：5
’‑
Biotin
‑
TTCAAAGATTCGATGATTCACGTCTGCAAG
‑3’
；所述探针的核苷酸序列为P：5
’‑
FAM
‑
ACTGATTTGGATTTTAAAACTAACCCAACG[THF]TAAGTTCAACTAAAC
‑
C3spacer
‑3’
。2.一种用于检测耳念珠菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含由权利要求1所述的引物探针组合组成的引物探针混合液。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含A Buffer、B Buffer、RAA反应干粉试剂、ddH2O；优选地，所述A Buffer为20％PEG；优选地，所述B Buffer为280mM MgAc；优选地，所述RAA反应干粉试剂中包含如下的组分：dNTP、SSB蛋白、recA重组酶蛋白或Rad51、Bsu DNA聚合酶、Tricine、PEG、二硫苏糖醇、肌酸激酶、Nfo核酸内切酶；更优选地，所述RAA反应干粉试剂中各组分的浓度如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶、100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含侧流层析试纸条。5.一种基于RAA
‑
侧流层析技术非诊断和治疗目的地检测耳念珠菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)提取待测样本DNA；(2)以待测样本DNA为模板，进行RAA扩增反应，得到扩增产物，其中，RAA扩增的上游引物的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨英，张欣然，马腾，王宇辰，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：