一种与萝卜抗根肿病相关的KASP分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种与萝卜抗根肿病相关的KASP分子标记及其应用，通过QTL

【技术实现步骤摘要】
一种与萝卜抗根肿病相关的KASP分子标记及其应用


[0001]本专利技术涉及萝卜根肿病的分子标记，属于生物检测领域。

技术介绍

[0002]根肿病是世界范围内的毁灭性土传植物病害，可造成20％～90％的严重减产。主要危害十字花科作物，如萝卜、油菜、白菜、甘蓝等。根肿病的病原为芸薹根肿菌(Plasmodiophorabrassicae)。
[0003]萝卜(Raphanussativus L.，2n＝18)，为十字花科萝卜属作物，是我国重要的传统蔬菜，并在世界各地广泛种植。近年来，在湖北、河南、云南、四川以及东北地区，萝卜根肿病发生逐渐增多，个别地区甚至爆发根肿病，导致土地无法耕种而抛荒或者改种其他作物。
[0004]萝卜田间根肿病的发生受到多种环境因素影响，在田间温度10～30℃，土壤相对湿度60％～98％，pH为5.4～6.5时，根肿病均能发生。萝卜发病初期，地上部分无明显症状，主根或侧根形成形状不一、大小不等，呈零星或簇状连片分布的肿瘤；随着肿瘤逐渐膨大或增多，影响植物吸收养分，导致植株生长缓慢，叶片萎蔫失绿；感病后期，在主根上表现龟裂、孔洞、塌陷和畸形等症状；肿瘤也会受到杂菌侵染，根部腐烂变臭。
[0005]目前预防根肿病主要有农业措施、生物防治和化学防治，选育抗病品种是防治萝卜根肿病最经济有效的策略。然而，国内外关于萝卜抗根肿病定位的研究较少，缺乏具有应用价值的分子标记，限制了其在分子育种中的应用。
[0006]使用与根肿病抗性基因紧密连锁的分子标记，在苗期就可对植株抗性进行筛选与鉴定，提高抗病材料鉴定效率，有效缩短抗根肿病品种的培育年限。因此，开发萝卜抗根肿病连锁分子标记，对萝卜抗根肿病品种的培育具有重要的应用价值。
[0007]萝卜中关于抗根肿病遗传机制及分子标记研究报道较少。国内外学者尽管从不同的种质中鉴定出萝卜抗根肿病QTL位点，但遗传距离较远或为数量位点控制，导致开发的分子标记无法快速有效应用于育种实践。

技术实现思路

[0008]本专利技术的是在定位的萝卜抗根肿病QTL区间内，开发了与性状紧密连锁的分子标记并验证了标记的可靠性，通过检测该分子标记就可以预测萝卜对根肿病的抗性，为实现萝卜抗根肿病的的鉴定和筛选提供了分子标记辅助选择技术。
[0009]本专利技术第一个方面，提供一种SNP分子标记，所述SNP分子标记位点位于萝卜2号染色体第21832653个碱基处，SNP标记为G到A转换，通过提取该标记上下游100个碱基的序列信息(GCGTGATGGACTCTGCTCGGTCAGCGAGCTTCCACCAGAGGAGTAACGT[G/A]AACAAGATGCAGAGAGGAGAGAGAGGTTCGGTTTCATCACTGAGCACGAC)，利用引物设计软件，将该标记转化为KASP标记，通过利用高通量的IntelliQube基因分型检测平台进行基于竞争性等位基因特异性PCR(KSAP技术)的SNP基因分型检测试验，实现标记的多态性检验，从而实现对萝卜抗根肿病的分子标记辅助筛选。
[0010]本专利技术的第二个方面提供一种检测SNP的特异性引物组，所述的引物组为SNP标记转化后的KASP引物，所述的引物序列为：
[0011]正向引物1，F
‑
1:CTCTCTCCTCTCTGCATCTTGTTT
[0012]正向引物2，F
‑
2:CTCTCTCCTCTCTGCATCTTGTTC
[0013]反向引物，R:TGCTCGGTCAGCGAGCTTCCAC。
[0014]本专利技术的第三个方面是提供一种SNP的检测方法，所述的方法是采用第二方面所述的引物，以提取的植物的基因组为模板，通过利用高通量的IntelliQube基因分型检测平台进行基于竞争性等位基因特异性PCR(KASP)反应，所述的KASP反应体系：反应体系参照LGC公司的IntelliQube平台说明书进行，具体包含KASP引物混合物、KASP主混合物和DNA模板。其中KASP引物混合物包含两条等位基因特异性正向引物和一条共用反向引物；KASP主混合物包含F
‑
1尾部FAM标记的寡序列，F
‑
2尾部HEX标记的寡序列，FAM染料，HEX染料，淬灭剂；DNA模板是萝卜基因组DNA。
[0015]在一个具体的实施例中，所述的
[0016]KASP试验步骤：以下步骤可简化
[0017]1.将DNA样品分装到96孔PCR板上。将DNA样品调制成统一的适宜的浓度(5
‑
10ng/μl)，加到96孔PCR板上，每块PCR板加2个阴性对照(NTC)。
[0018]2.配制KASP基因分型混合液。参照384孔array tape，其中湿DNA：0.8ul，2x KASP Master mix+Assay：0.8ul，总反应体积：1.6ul
[0019]3.将KASP基因分型混合液加到已含DNA模板的array tape膜上。利用IntelliQube的SNP基因检测平台编制程序，并依次将384Array tape、DNA样品板、KASP基因分型混合液放置进机器，操作机器执行程序，分别自动进行DNA样品稀释液和KASP基因分型混合液向384孔的array tape分装、封膜的过程。
[0020]4.进行PCR循环反应。PCR反应可在IntelliQube机器内以SNP genotyping inline(单张膜时)模式进行，亦可在Hydrocycler内以SNP genotyping outline(多张膜时)模式进行水浴PCR。程序设置如下：1.预变性：温度94℃，15min，1次循环；2.变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度61
‑
55℃，60sec(
‑
0.6℃/循环)；第2步10次循环；3.变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度55℃，60sec，第3步26次循环。
[0021]5.荧光数据读取和分析。PCR反应结束后，利用IntelliQube机器进行荧光数据读取和分析。荧光FAM激发(nm)485，发射(nm)520；HEX激发535，发射556，ROX激发575，发射610。
[0022]6.加循环。如果数据荧光信号较低，分群较散，可增加循环后进行荧光读取。加循环的条件如下：变性：温度94℃，20sec；复性/延伸：温度57℃，60sec，循环数为3。
[0023]KASP分型结果：
[0024]首先，以上引物和所述方法能够在萝卜上检测与抗根肿病相关的主效QTL位点是否存在，同时检测标记的多态性类型，标记类型与相应的植株抗性表型一致，通过标记类型预判萝卜对根肿病的抗性。
[0025]本专利技术的有益效果：本专利技术通过QTL
‑
seq技术以及遗传图谱定位发现了位于萝卜2号染色体上与抗根肿病相关的主效QTL位点，并进一步开发了与位点紧密连锁的分子标记，通过对抗性未知萝卜材本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种萝卜抗根肿病的分子标记的核苷酸分子，所述的分子标记包含SNP位点，所述SNP位点位于萝卜2号染色体第21832653个碱基处，SNP标记为G到A转换；所述的分子标记的核酸序列包含SEQ ID NO:1所示的DNA。2.一种特异性检测如权利要求1所述的萝卜抗根肿病分子标记的引物组，所述的引物组应用于KASP反应。3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述的引物组的序列为：正向引物1，F
‑
1:CTCTCTCCTCTCTGCATCTTGTTT(SEQ ID NO:2)；正向引物2，F
‑
2:CTCTCTCCTCTCTGCATCTTGTTC(SEQ ID NO:3)；反向引物，R:TGCTCGGTCAGCGAGCTTCCAC(SEQ ID NO:4)。4.一种特异性检测萝卜抗根肿病分子标记的方法，所述的方法是利用权利要求2或3所述的引物组，利用KASP的方法扩增萝卜基因组。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的KASP方法具体为：以提取的植物的基因组为模板，通过利用高通量的IntelliQube基因分型检测平台进行基于竞争性等位基因特异性PCR(KASP)反应；所述的KASP反应体系包含KASP引物混合物、KASP主混合物和DNA模板。6.根据权利要求5所述的方法，其中KASP引物混合物包含两条等位基因特异性...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪精磊，包崇来，胡天华，王五宏，胡海娇，魏庆镇，严亚琴，王益奎，黎炎，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：