本发明专利技术公开了一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法，该方法包括：取欧洲越橘茎叶作为外植体，诱导其长出一层薄薄的愈伤组织；将该带有一层薄薄愈伤组织的外植体材料放入加有生长素IBA、细胞分裂素ZT和乙酰丁香酮的农杆菌侵染液中进行侵染培养，侵染培养过程中对材料进行超声破碎和真空渗透等处理，促进农杆菌质粒进入植物材料；然后将侵染后的外植体材料进行共培养后再将转基因材料移至筛选培养基中进行筛选，最终获得表现出报告基因(甜菜素合成基因)所呈现的洋红色(玫红色)欧洲越橘愈伤组织。本发明专利技术采用特定的愈伤诱导培养基、农杆菌侵染处理、共培养培养基、共培养时间、抗性愈伤组织筛选培养基等进行根癌农杆菌介导的欧洲越橘愈伤组织转基因体系的构建，得到了转基因成功的玫红色愈伤组织，并且转化率也提高至4％。且转化率也提高至4％。
【技术实现步骤摘要】
一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法
[0001]本专利技术涉及林木转基因
，尤其涉及一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法。
技术介绍
[0002]欧洲越橘(Vaccinium myrtillus Linn.)，又名欧洲蓝莓、钟莓(bilberry)，是杜鹃花科 (Ericaceae)越橘属(Vaccinium Spp.)植物，它是一种低矮灌木，原产于北欧，如今在很多地区也有发现，含有30多种花青素，是含有最多花青素种类的越橘品种，也是花青素最丰富的天然来源之一，含量高达37.47％，具有很高的经济价值，药用价值等，被美国草本产品协会列为1类草本植物
[1,2]。欧洲越橘整个植物被用于传统医药，最常用于治疗眼部疾病
[3]，而浆果主要作为新鲜或腌制食品来食用
[4]；除此之外，越橘也可用于生产膳食补充剂。由于越橘它浓郁的味道和颜色，越橘往往比蓝莓(伞状蓝莓、狭叶越桔)更受消费者青睐。随着人们对越橘不断增长的需求，人们对改进越橘的种植和生产也越来越感兴趣。
[0003]在越橘属中，无性系繁殖与转基因技术最成熟的是蓝莓。蓝莓与欧洲越橘的果实形状很像，属于越橘属下的蓝莓亚属，蓝莓的商品化程度和种植推广程度最高，现有越橘属植物的转基因方法都是以蓝莓为材料开发的。鉴于越橘的价值，早在1993年便有研究员Rowland 等开始了越橘属高丛蓝莓的转基因研究，尽管最终没有成功
[5]；之后在1998年Cao等利用根癌农杆菌菌株EHA105，以北方高丛蓝莓和南方高丛蓝莓腋芽为研究材料，进行了转基因研究，最终成功构建了蓝莓的转基因体系，并且发现农杆菌菌株EHA105的转化效率比 LBA4404的要更高。影响转基因效率的因素除农杆菌菌株外
[6]，还有共培养天数、培养年限和植物基因型等也影响蓝莓转基因效率
[7]；2004年，Song等学者使用根癌农杆菌介导法来进行蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)转化的研究，包括Aurora、Blue crop、Brigitta和 Legacy四种蓝莓。研究发现，在转基因方面，农杆菌EHA105菌株比LBA4404或 GV3101更有效，共培养时间为6d时转基因效果最好，与1998年的研究结果相同，除此之外，乙酰丁香酮(AS)也会影响转基因效率；Aurora、Blue crop、Brigitta和 Legacy四种蓝莓对应的转化率为15.3％、5％、10％和5.6％
[8]。学者Song在2012 年又发布了关于蓝莓转基因的新进展，以南方高丛蓝莓品种Legacy为研究材料，转入蓝莓 C
‑
重复结合因子(CBF)基因，阐明了CBF调控网络可以提高蓝莓的耐寒性
[9]。020年学者 Masafumi等以在日本实验农场种植的两个高丛蓝莓品种
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)为实验研究材料，借助CRISPR/Cas9技术，研究了基因组编辑技术对蓝莓转化的影响，结果表明基因组编辑技术有助于加快蓝莓育种，促进蓝莓转化
[10]。
[0004]现有关于越橘属植物转基因方面的研究都是在以蓝莓为研究材料上进行的，越橘还没有转基因体系。现有的关于越橘属植物的转基因方法都仅限于高丛蓝莓，均不适用于欧洲越橘，所以现在我们亟需开发欧洲越橘的转基因体系，以利于欧洲越橘的分子育种及基因研究。
技术实现思路
[0005]本专利技术提供了一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法，该方法以欧洲越橘的幼嫩茎叶为实验材料，在欧洲越橘愈伤组织再生体系的基础上实现了以根癌农杆菌介导的遗传转化，建立了欧洲越橘稳定且快速的遗传转化体系。
[0006]具体技术方案如下：
[0007]一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0008](1)以在无菌培养基上生长良好的欧洲越橘苗的幼嫩叶片为外植体材料，将该外植体材料切成合适大小，接种至诱导愈伤的培养基中培养，得到有愈伤的外植体；所用培养基配方为：WPM+3％蔗糖+1％琼脂+0.50mg/L IBA+2.0mg/L ZT,pH＝5.2
±
0.02；
[0009](2)材料在再生培养基中生长10
‑
14d后将其作为侵染材料，然后将其放入准备好的农杆菌侵染液中进行侵染培养；
[0010](3)待侵染培养结束后，倒出侵染液，将侵染完成的材料在滤纸上晾干，放入共培养培养基中，进行共培养；所述共培养培养基为：WPM+3％蔗糖+0.85％琼脂+0.70mg/L IBA+2.0mg/L ZT+20mg/L AS,pH＝5.2
±
0.02；
[0011](4)共培养结束后，用无菌水清洗转基因材料，晾干后将其放入筛选培养基中进行筛选培养，直至转基因材料愈伤组织越长越大,并表现出报告基因(甜菜素合成基因)所呈现的洋红色；所述筛选培养基为：WPM+3％蔗糖+0.85％琼脂+0.70mg/L IBA+2.0mg/L ZT +5mg/L HYG+400mg/L Carb,pH＝5.2
±
0.02；
[0012]本专利技术使用的报告基因为甜菜素合成基因。报告基因在愈伤组织表达后，可以在转基因成功的愈伤组织中生成甜菜素，从而是阳性转基因愈伤呈现洋红色，不需要经过其他处理便可进行转基因阳性愈伤组织的判断，为我们转基因体系的建立节省了时间。
[0013]进一步地，步骤(1)中，幼嫩枝条切为0.8cm左右的小段，叶片除去边缘部分切为0.5 cm左右的方形；外植体接种方式为：叶片平铺在培养基表面，正面朝下；愈伤组织诱导培养的条件为：每天28℃条件下黑暗培养16h；
[0014]进一步地，步骤(2)中，农杆菌种类为：陈其军实验室开发的三元体系中使用的LBA4404. 这里写为LBA4404
‑
ternary；
[0015]进一步地，步骤(2)中，侵染液为：加入1.4mg/L IBA、4mg/L ZT、10mg/L AS的WPM溶液；
[0016]进一步地，步骤(2)中，侵染条件为：28℃摇床先摇20
‑
30min,再对材料进行超声破碎(振幅60％)1min和真空渗透3次，每次5min，之后再28℃摇床摇2h；
[0017]进一步地，步骤(3)中，共培养条件为：28℃黑暗条件下培养8d；
[0018]进一步地，步骤(4)中,共培养结束后，用含400mg/L羧苄的灭菌RO水清洗转基因材料，清洗10遍左右，每遍30
‑
60s；所述筛选培养条件为：28℃黑暗条件培养，每两周继代一次，继代两次后将材料移至28℃光照条件下培养，每天光照16h，黑暗8本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种根癌农杆菌介导的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，包括：(1)以在无菌培养基上生长良好的欧洲越橘苗的幼嫩叶片为外植体材料，将该外植体材料切成合适大小，接种至诱导愈伤的培养基中培养，得到有愈伤的外植体；所用培养基配方为：WPM+3％蔗糖+1％琼脂+0.50mg/L IBA+2.0mg/L ZT,pH＝5.2
±
0.02；(2)材料在再生培养基中生长10
‑
14d后将其作为侵染材料，然后将其放入准备好的农杆菌侵染液中进行侵染培养；(3)待侵染培养结束后，倒出侵染液，将侵染完成的材料在滤纸上晾干，放入共培养培养基中，进行共培养；所述共培养培养基为：WPM+3％蔗糖+0.85％琼脂+0.70mg/L IBA+2.0mg/L ZT+20mg/L AS,pH＝5.2
±
0.02；(4)共培养结束后，用无菌RO水清洗转基因材料，晾干后将其放入筛选培养基中进行筛选培养，直至转基因材料愈伤组织越长越大,并表现出报告基因(甜菜素合成基因)所呈现的洋红色(玫红色)；所述筛选培养基为：WPM+3％蔗糖+0.85％琼脂+0.70mg/L IBA+2.0mg/L ZT+5mg/L HYG+400mg/L Carb,pH＝5.2
±
0.02。2.如权利要求1所述的欧洲越橘转基因体系的建立方法，其特征在于，步骤(1)中，幼嫩枝条切为0.8cm左右的小段，叶片除去边缘部分切为0.5cm左右的方形；外植体接种方式为：叶片...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔富强，宋艳平，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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