本发明专利技术属于基因工程和转基因技术领域，具体涉及一种玉米自交系KN5585的转化方法。本发明专利技术通过对热激幼胚、幼胚悬浮时间、农杆菌活化培养基、侵染培养基和选择培养基中的草丁膦筛选剂浓度等参数进行优化，将KN5585受体的转化效率从0.53％提高到26.22％。利用本发明专利技术提供的方法，可以实现以玉米自交系KN5585为受体的高效遗传转化，从而培育具有特定性状的转基因KN5585玉米品种。KN5585玉米品种。KN5585玉米品种。
【技术实现步骤摘要】
玉米自交系KN5585的转化方法
[0001]本专利技术属于基因工程和转基因
，具体涉及一种玉米自交系KN5585的转化方法。
技术介绍
[0002]遗传转化是培育转基因玉米品种的基本技术体系。农杆菌介导的转化方法具有整合位点稳定、拷贝数低、后代遗传稳定等优势，已成为主流的转化方法。然而基因型是限制农杆菌介导法玉米转化效率的重要因素。同样的转化方法在不同基因型玉米(即不同的受体玉米品种)上表现出的转化效率有着天壤之别。因此需要根据具体的受体材料开发对应的转化方法。
[0003]Hi
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II、A188是国外转基因玉米开发和玉米转化常用的受体材料，然而这些材料并不适合国内的种植环境。开发国内骨干自交系的转化方法对于发展我国玉米转基因技术具有重要意义。现阶段已经能够实现转化的国内玉米自交系包括综3、综31(杨会，王国英，戴景瑞.玉米优良自交系综3、综31的转化研究[J].农业生物技术学报，2001，9(4)：334
‑
337.)、祥249(CN 104745622 B)、AY63(CN 107022561 B)、X178(CN 105567730 A)、京724(CN 111154796 A)等。更多的玉米自交系或杂交品种的转化方法尚没有建立。
[0004]KN5585是未米生物科技(江苏)有限公司以祥249为母本开放授粉获得的F1代中选出的单株经自交6代选育获得的玉米自交系品种。该品种综合农艺性状表现良好，具有一定的市场价值，且已经受理植物新品种权申请，申请号20191002444。然而该自交系品种还没有成熟高效的转化方法，这为以该自交系品种为受体，通过转基因技术进一步改良KN5585的特定性状带来了障碍。
[0005]为解决上述问题，本专利技术对热激幼胚、幼胚悬浮时间、农杆菌活化培养基、侵染培养基和选择培养基中的草丁膦筛选剂浓度等参数进行优化，将KN5585受体的转化效率从0.53％提高到26.22％。利用本专利技术提供的方法，可以实现以玉米自交系KN5585为受体的高效遗传转化，从而培育具有特定性状的转基因KN5585玉米品种。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的是提供一种玉米自交系KN5585的转化方法。
[0007]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]本专利技术提供了一种培养基组合，其特征在于，包括如下培养基：
[0009]农杆菌活化培养基：D
‑
葡萄糖20g/L+MES 19.5g/L+NaH2PO
4 0.06g/L+NH4Cl 1g/L+MgSO4
·
7H2O 0.3g/L+KCl 0.15g/L+CaCl2·
2H2O 0.0132g/L+FeSO4·
7H2O 0.0025g/L+琼脂15g/L；和
[0010]悬浮培养基：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L
‑
脯氨酸0.115g/L；和
[0011]侵染培养基：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L
‑
脯氨酸0.115g/L+乙酰丁香酮200mM+半胱氨酸200mg/L；和
[0012]共培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+L
‑
半胱氨酸200mg/L+2,4
‑
D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+乙酰丁香酮200mM；和
[0013]休息培养基：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4
‑
D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L；和
[0014]选择培养基：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4
‑
D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L+草丁膦40mg/L；和
[0015]分化培养基：MS+蔗糖20g/L+6
‑
BA 0.1mg/L+KT 1mg/L+特美汀200mg/L；和
[0016]生根培养基：MS+蔗糖20g/L+MES 0.5g/L+IBA 0.2mg/L。
[0017]本专利技术还提供了上述培养基组合在玉米遗传转化中的应用。
[0018]在一些实施方案中，上述的玉米为自交系KN5585。
[0019]本专利技术还提供了一种玉米的遗传转化方法，其特征在于：包括如下步骤：
[0020]1)将含有草丁膦抗性基因的AGL1或EHA105农杆菌菌株在活化培养基上划线，28℃黑暗培养24h；
[0021]2)将玉米自交系授粉后6
‑
15天，玉米幼胚长至0.5
‑
2.0mm时从玉米穗上剥取获得的幼胚浸入悬浮培养基，悬浮浸泡10
‑
30min，完成幼胚收集后移走液体，热激5min，再加入携带含有草丁膦抗性基因的AGL1或EHA105农杆菌的侵染培养基中侵染5min，期间向农杆菌侵染液中吹打空气；
[0022]3)将幼胚移至共培养基上，23℃黑暗培养48
‑
96h；
[0023]4)将幼胚移至休息培养基上，26
‑
34℃黑暗培养1
‑
2周；
[0024]5)将幼胚移至选择培养基上培养，选择培养基中含草丁膦诱导抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养3周，分化形成再生小苗；
[0025]6)再生小苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米；
[0026]其中，所用到的培养基配方如上所述。
[0027]在一些实施方案中，上述步骤2)中所述的玉米自交系为KN5585。
[0028]在一些实施方案中，上述步骤2)中所述的吹打空气的具体操作方法为：使用一次性滴管或装载200μL或1000μL枪头的移液器，每隔10s左右向浸泡外植体的农杆菌进行吹打，共吹打3
‑
5次，产生气泡。
[0029]本专利技术的优点及有益效果如下：本专利技术对热激幼胚、幼胚悬浮时间、农杆菌活化培养基、侵染培养基和选择培养基中的草丁膦筛选剂浓度等参数进行优化，将KN5585受体的转化效率从0.53％提高到26.22％。利用本专利技术提供的方法，可以实现以玉米自交系KN5585为受体的高效遗传转化，从而培育具有特定性状的转基因KN5585玉米品种。
附图说明
[0030]图1载体图谱
具体实施方式
[0031]提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种培养基组合，其特征在于，包括如下培养基：农杆菌活化培养基：D
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葡萄糖20g/L+MES 19.5g/L+NaH2PO
4 0.06g/L+NH4Cl 1g/L+MgSO4
·
7H2O 0.3g/L+KCl 0.15g/L+CaCl2·
2H2O 0.0132g/L+FeSO4·
7H2O 0.0025g/L+琼脂15g/L；和悬浮培养基：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L
‑
脯氨酸0.115g/L；和侵染培养基：1/2MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+L
‑
脯氨酸0.115g/L+乙酰丁香酮200mM+半胱氨酸200mg/L；和共培养基：1/2MS+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+脯氨酸0.115g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+L
‑
半胱氨酸200mg/L+2,4
‑
D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+乙酰丁香酮200mM；和休息培养基：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4
‑
D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L；和选择培养基：MS+蔗糖30g/L+脯氨酸1.38g/L+盐酸硫胺素0.5mg/L+AgNO3 20mM+水解酪蛋白0.5g/L+2,4
‑
D 0.5mg/L+毒莠定2.2mg/L+特美汀200mg/L+草丁膦40mg/L；和分化培养基：MS+蔗糖20g/L+6
‑
BA 0.1mg/L...
【专利技术属性】
技术研发人员：许洁婷，严建兵，韩宝柱，李梦娇，朱东杰，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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