黄曲霉菌及其在防治植物病原真菌中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一株黄曲霉菌及其在防治植物病原真菌中的应用，属于生物农业技术领域。所述黄曲霉菌（Aspergillus flavus）PLA01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022832。本发明专利技术的黄曲霉菌PLA01可抑制致植物病原真菌的生长，效果显著，对绿色防治的发展具有重要意义。色防治的发展具有重要意义。色防治的发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
brevisporum)、灰霉菌(Aspergillus flavus)、禾谷镰孢菌(Botrytis cinerea)。将黄曲霉菌PLA01与病原菌共培养，结果显示该菌株可以与植物病原菌竞争营养物质与生长空间从而达到抑菌效果。取黄曲霉菌PLA01的培养物进行LC
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MS检测，结果表明，该菌株可以分泌曲酸等抗菌物质抑制病原真菌生长。根据以上结果可知，黄曲霉菌PLA01对植物病原菌生长的抑制率在24.5％
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100％。
[0010]本专利技术的目的之三还提供了一种抑制植物病原菌生长的制剂，该制剂的活性成分为黄曲霉菌PLA01，所述菌株的孢子、所述菌株的培养物及其浓缩物、萃取物、干燥物组成的组中的一种(及以上)有效成分。在本专利技术中以核盘菌为例，将浓度为108个/mL的黄曲霉菌PLA01孢子悬浮液喷洒在毛豆上，对菌核病的预防效果高达100％，对其治疗效果达到50％。
[0011]与现有技术相比，本专利技术将一株不产黄曲霉毒素和环匹阿尼酸的黄曲霉菌PLA01应用于抑制致植物病原真菌的生长，效果显著，并提供了一种治疗和/或预植物病原菌的制剂。本专利技术为今后不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌在田间的生物防治提供了生防菌来源，对绿色防治的发展具有重要意义。
附图说明
[0012]图1为实施例1中黄曲霉菌PLA01在PDA固体培养基中生长的菌落形态(A)，黄曲霉菌PLA01在普通光学显微镜下的菌丝及孢子形态(B)，黄曲霉菌PLA01菌株的5.8S rRNA序列(C)，黄曲霉菌PLA01菌株的进化树(D)。/>[0013]图2为实施例2中黄曲霉菌PLA01分泌物的一级全扫质谱描图(A)，黄曲霉菌PLA01基因组中黄曲霉毒素合成基因簇和环匹阿尼酸合成基因簇PCR扩增结果图(B)。
[0014]图3为实施例3中核盘菌、甘薯长喙壳菌、黑附球菌、亚洲镰孢菌、短孢炭疽菌、灰霉菌、禾谷镰孢菌与黄曲霉菌PLA01的拮抗活性图(A)，病原菌与黄曲霉菌PLA01共培养时的菌落直径统计图(B)。
[0015]图4为实施例4中使用伊文思蓝染液和中性红染液对黄曲霉菌PLA01与核盘菌共培养的核盘菌菌丝活性染色图。
[0016]图5为实施例5中黄曲霉菌PLA01分泌物中检测到的曲酸二级质谱图(A)，黄曲霉菌PLA01分泌物的HPLC检测图(B)。
[0017]图6为实施例6中多头黄曲霉菌PLA01对核盘菌的空间竞争SEM镜检图。
[0018]图7为实施例7中黄曲霉菌PLA01与核盘菌的葡萄糖竞争消耗关系图(A)，在不同条件下核盘菌孢子聚集体的计数图(B)。
[0019]图8为实施例8中黄曲霉菌PLA01在毛豆上的生长示意图(A)，毛豆豆荚上黄曲霉菌PLA01的数量随时间变化的统计图(B)。
[0020]图9为实施例9中预防组对照实验和黄曲霉菌PLA01孢子悬浮液处理实验得到的毛豆豆荚核盘菌的生长情况图(A)，治疗组对照实验和黄曲霉菌PLA01孢子悬浮液处理实验得到的毛豆豆荚核盘菌的生长情况图(B)。
具体实施方式
[0021]本专利技术提供了一株不产黄曲霉毒素和环匹阿尼酸的黄曲霉菌(Aspergillus flavus)PLA01，并将其应用于抑制致植物病原真菌的生长。下面结合附图和具体实施例对
本专利技术作进一步详细说明，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
[0022]以下实施例中，所采用的培养基配方如下：
[0023]1、PDA固体培养基(1L)
[0024]试剂质量马铃薯200g葡萄糖20g琼脂粉15g蒸馏水1L
[0025]按配方备料，煮沸约30min，待各组分溶解后采用湿热灭菌法于121℃灭菌15min。
[0026]2、PDA液体培养基(1L)
[0027]试剂质量马铃薯200g葡萄糖20g蒸馏水1L
[0028]按配方备料，煮沸约30min，待各组分溶解后采用湿热灭菌法于121℃灭菌15min。
[0029]3、YEPD培养基
[0030]试剂质量酵母提取物150mg胰蛋白胨500mg葡萄糖1g蒸馏水50mL
[0031]各组分溶解后，采用湿热灭菌法于121℃灭菌15min。
[0032]4、大麦
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蜂蜜
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蛋白胨培养基配方(40mL)
[0033]试剂质量大麦100mg蜂蜜600mg蛋白胨200mg蒸馏水40mL
[0034]备料后于121℃湿热法灭菌1h。
[0035]实施例1
[0036]黄曲霉菌PLA01的分离和鉴定
[0037](1)菌株的分离：
[0038]猕猴桃先用70％乙醇表面消毒30s后，再在1％NaClO4浸泡1min，随后用无菌ddH2O洗涤。控干后，用无菌镊子取猕猴桃表皮组织接种在含有25μg/mL氯霉素的PDA固体培养基上，于28℃恒温箱避光培养3天。三天后用无菌接种环挑取菌丝，并接种于新的PDA固体培养基中，28℃恒温箱避光培养。不断纯化，直至得到形态单一的菌落，纯化后的菌落形态如图1
(A)所示，黄曲霉菌落散状分布，呈绿色，反面无色，菌落表面呈粉末状。在光学显微镜下观察其菌丝和分生孢子的形态，如图1(B)所示，分生孢子梗和分生孢子清晰可见，分生孢子近球形。
[0039](2)菌株的鉴定：
[0040]菌饼制备：将斜面保存的黄曲霉菌菌株接种于PDA固体培养基中，于28℃恒温箱避光培养3天，用直径7mm的打孔器于菌落边缘切取，制备成菌饼备用。
[0041]菌株DNA的提取：取一个菌饼，接种于50mL PDA液体培养基中，于摇床28℃，200rpm培养三天。将培养后的培养液转移至50mL离心管，用冷冻离心机4℃，7000rpm，离心20min后，弃上清，收集菌丝。用灭菌ddH2O将获得的菌丝洗涤3次后，将菌丝转入无菌且预冷的研钵中，加入适量液氮，充分研磨至菌丝呈现为固体粉末状。待粉末溶为蛋清样液体后，用真菌全基因组提取试剂盒提取真菌基因组DNA。用真菌鉴定通用引物ITS4(5
’‑
TCCTCCGCTTATTGATATGC
‑3’
，SEQ ID NO.1)和ITS5(5
’‑
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG
‑3’
，SEQ ID NO.2)对提取出的基因组进行PCR扩增，20μL的体系中加入2X primerStar buffer 10μL、5nmol的ITS4和ITS5各1μL、菌丝DNA提取液1μL、补ddH2O至20μL。扩增条件为：扩增条件为：95℃5min变性；95℃30s，54℃30s，72℃1min，32个循环；72℃10min延伸。再用1％凝胶电泳初步验证扩增结果。利用Takara琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.黄曲霉菌（Aspergillus flavus）PLA01，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M 2022832。2.权利要求1所述的黄曲霉菌（Aspergillus flavus）PLA01在防治植物病原真菌中的应用，所述植物病原菌为核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、甘薯长喙壳菌（Ceratocystis fimbriata）、...

【专利技术属性】
技术研发人员：王苏妍，拉博德，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：