一种草酸青霉菌的固态发酵方法技术

本发明专利技术公开了一种草酸青霉菌孢子的发酵方法，通过室内生测试验及室外大田试验验证了该菌株杀蚜虫时的孢子活性，并通过后续优化试验确定该菌株最适的发酵培养基组分以及生长条件：以质量份计，玉米粉12.5g、麦麸皮12.5g、可溶性淀粉10％、酵母浸粉10％、接种量60％，初始含水量70％，培养温度33℃，培养时间9天。在本发明专利技术所提供的培养条件下，该菌株产孢子量高达6.76

【技术实现步骤摘要】
一种草酸青霉菌的固态发酵方法


[0001]本专利技术属于微生物
，涉及微生物发酵及其应用，具体涉及一种草酸青霉菌的发酵方法及其在蚜虫等作物病害防治方面的应用。

技术介绍

[0002]蚜虫是分布广泛，防治难度较大的农林害虫之一，且危害的植物范围十分广泛，涉及2672120属(方燕等，2006)。蚜虫危害植物时，排出大量的蜜露，污染叶片和果实，导致煤污病菌寄生，甚至影响植株叶片的光合作用，导致产品产量和质量严重下降(范广华等，2011)。目前对于蚜虫的防治，还是以化学防治为主，使用方便、见效快的优点使其在害虫防治中拥有不易撼动的地位。化学防治中能达到理想防治效果的各类常用药剂，包含有机磷类、新烟碱类、拟除虫菊酯类等等。这些物质虽然能够防治蚜虫，但同时也对益虫造成了毒害威胁，导致环境污染和生态系统破坏等负面影响，长期大量使用也会令蚜虫易产生抗药性而失去防治效果。此外，化学农药的使用存在较为普遍而严重的“三R”(农药残留Residue、抗药性Resistance、再增猖獗Resurgence)问题。因此寻找更为高效绿色的生物农药是刻不容缓的任务。
[0003]微生物杀虫剂是目前生物农药非常重要的组成部分，不论在基础研究还是产业化方面均走在了整个生物农药研究领域的前列。真菌、细菌、病毒等病原性微生物可广泛应用于防治蚜虫，如白僵菌、绿僵菌、蜡蚧轮枝菌、菊欧文氏杆菌、禾谷缢管蚜病毒、链霉菌等病原微生物在蚜虫防治方面的应用都取得了显著效果。但关于青霉菌防治蚜虫的状况，仅有报道提出可从青霉菌中提取杀蚜虫的活性物质，而未有实质性的研究。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在探索开发新型、高效、低毒、环保的杀蚜虫微生物菌剂。为达到上述目的，本专利的专利技术人以自主分离筛选出的一株草酸青霉菌为研究对象，提供了该菌孢子灭杀蚜虫的活性验证及孢子固态发酵方法。
[0005]本专利的专利技术人于2018年在陕西省咸阳市杨凌示范区桶张村一甜瓜(品种为绿宝石)种植大棚中，从甜瓜叶片中分离出一株内生真菌，通过菌落特征观察、细胞形态分析、生理生化特性鉴定等方法确认该菌株属于草酸青霉菌属。随后用分子生物学方法对该菌株16SrDNA序列进行测定。测序结果在NCBI上比对分析，以同源性在97％以上且同源性最高的物种判断为该菌株的种属。测序结果表明：该菌株16S rDNA基因序列与最近有效菌株Penicillium oxalicum strain TGQM01(MK 036020.1)的相似率为99.66％，从而确定其为草酸青霉菌，并命名为QLhf
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1。该菌种保藏信息为：
[0006]菌株名称：QLhf
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1；
[0007]保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；
[0008]保藏编号：CGMCC No.18544；
[0009]保藏时间：2019年09月06日。
[0010]菌种已申请专利(CN110964644A)。有关该菌株的筛选方法以及菌株的鉴定和具体保藏信息，在已申请专利CN101619294B中已有明确阐述，在此不作赘述。通过对QLhf
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1菌株活化、发酵培养、生测验证，确定该菌株可以防治桃树、草莓、苹果、花椒、小麦上的蚜虫。
[0011]基于所述应用，在本专利技术技术方案的启示下，本领域普通技术人员利用所述青霉菌用于防治蚜虫活性物质，并可基于现有技术，对该活性物质作进一步拓展应用，比如将该活性物质作为制备用于防治蚜虫的药剂的组分，或者通过适宜的途径或手段直接用该活性物质防治蚜虫。
[0012]根据本专利技术的试验结果，所述青霉菌的孢子可用于防治小麦上的蚜虫。
[0013]本专利技术给出了所述青霉菌孢子固态发酵方法。其发酵过程包括下述步骤：
[0014]1)活化所述草酸青霉菌。
[0015]2)种子培养，配制所述草酸青霉菌孢子悬浮液后接入种子培养基中，得到发酵菌种，孢子悬浮液浓度控制在107个/mL数量级。
[0016]3)接种发酵，将发酵菌种接入发酵培养基中。
[0017]具体地，活化所述草酸青霉菌的培养基选用PDA培养基，活化的条件为：培养温度33℃，培养时间4天。
[0018]所述种子培养基的组成为：蔗糖15g、酵母浸粉12.5g、黄豆饼粉7.5g、KH2PO41.0g、MgSO41.1g、NaCl 1.0g、蒸馏水1000mL，所述种子培养基的pH为6.8
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7.0。
[0019]本专利技术的实施例中种子培养基的组成：蔗糖15g、酵母浸粉12.5g、黄豆饼粉7.5g、KH2PO41.0g、MgSO41.1g、NaCl 1.0g、蒸馏水1000mL。
[0020]通过单因素试验优化，进行显著性差异分析，获得最优产孢体系，优化过程使用固态发酵培养基，所述发酵培养条件：固态发酵培养基以12.5g玉米粉和12.5g麦麸皮为固体基质，以质量份计，添加可溶性淀粉10％、酵母浸粉10％，装料量25g，接种量60％，初始含水量70％，培养温度33℃，培养时间9天。
[0021]具体的，适用于本专利技术的发酵方法的所述固态发酵培养基的组成为玉米粉15g、麦麸皮15g、种子液15mL、可溶性淀粉3g、黄豆饼粉3g、无菌水21mL。
[0022]本专利技术具备以下有益效果或优点：
[0023]本专利技术确定了所述青霉菌株杀虫的活性物质，根据本专利技术的试验结果和探索，所述活性物质为所述青霉菌的孢子。根据本专利技术的结果，所述青霉菌的孢子能够直接用于防治桃树、草莓、苹果、花椒、小麦等果蔬或农作物上的蚜虫，尤其是，所述青霉菌的孢子对桃树蚜虫的防治效果很好。基于本专利技术的技术方案，所述青霉菌的孢子可用于制备防治蚜虫的微生物菌剂，可以预测该菌在微生物农药、微生物制剂及其他蚜虫防治相关领域具有较好的开发应用前景。
[0024]同时本专利技术通过后续优化试验确定所述青霉菌株的孢子最适的培养基组分以及生长条件：12.5g玉米粉和12.5g麦麸皮为固体基质，可溶性淀粉10％，酵母浸粉10％，装料量25g，接种量60％，初始含水量70％，培养温度33℃，培养时间9天。优化后的培养条件大大提高了所述菌株产孢能力，使所述青霉菌株灭杀蚜虫的能力达到理想目标。
[0025]同时通过对培养基组分中碳氮源种类、装料量、初始含水量、接种量、发酵时间的选择，建立单因素试验并进行显著性差异分析，得到使所述菌株产孢量最高的培养基组分及配比。
[0026]本申请还提供了草酸青霉菌QLhf
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1发酵产物在防治农业虫害中的应用，具体地，所述虫害包括蚜虫。
[0027]进一步地，本专利技术还要求保护一种农用组合物，所述农用组合物含有所述草酸青霉菌QLhf
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1，或含有所述草酸青霉菌QLhf
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1的发酵产物，或含有所述草酸青霉菌QLhf
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1及其发酵产物。
[0028]同时本专利技术采用固体发酵方法培养菌株，培养过程具有操作简便、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.草酸青霉菌QLhf
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1的发酵方法，其特征在于，活化所述草酸青霉菌；种子培养，配制所述草酸青霉菌孢子悬浮液后接入种子培养基中，得到发酵菌种，孢子悬浮液浓度控制在107个/mL数量级；接种发酵，将发酵菌种接入发酵培养基中。2.根据权利要求1所述草酸青霉菌QLhf
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1的发酵方法，其特征在于，所述草酸青霉菌QLhf
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1，菌株保藏于CGMCC；保藏时间为2019年09月06日，保藏编号CGMCCNo.18544。3.根据权利要求1所述草酸青霉菌QLhf
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1的发酵方法，其特征在于，活化所述草酸青霉菌的培养基选用PDA培养基，活化的条件为：培养温度33℃，培养时间4天。4.根据权利要求1所述草酸青霉菌QLhf
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1的发酵方法，其特征在于，所述种子培养基的组成为：蔗糖15g、酵母浸粉12.5g、黄豆饼粉7.5g、KH2PO41.0g、MgSO41.1g、NaCl1.0g、蒸馏水1000mL，所述种子培养基的pH为6.8
...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦宝福，吴文君，刘晓丽，曹让，宋雨欣，吕晨静，祁志军，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：