本发明专利技术公开了一种shRNA及其表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌，还公开了该shRNA对于家蚕Bmp53基因干涉的应用。本发明专利技术利用慢病毒载体的广泛感染能力，构建家蚕功能基因的shRNA稳定表达载体并应用到个体水平，开发了一种家蚕基因功能研究的新工具。一种家蚕基因功能研究的新工具。一种家蚕基因功能研究的新工具。
【技术实现步骤摘要】
一种家蚕Bmp53基因的shRNA及其应用
[0001]本专利技术涉及一种RNA干扰
，尤其涉及一种家蚕Bmp53基因的shRNA及其应用。
技术介绍
[0002]RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double
‑
stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默。RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而使基因功能丧夫或基因表达量降低，因此RNAi可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。家蚕是鳞翅目模式昆虫，研究其关键性状基因功能可为鳞翅目害虫的防治提供坚实的理论基础。作为研究基因功能的有力工具，RNAi在家蚕细胞和个体的应用多为dsRNA直接干涉，效果不稳定且作用时间短暂，应用受到较大限制。
[0003]慢病毒是逆转录病毒的一种，作为基因治疗载体发展起来。利用慢病毒构建的shRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到宿主基因组上，进行持久的稳定表达。pLKO.1是一种复制缺陷型慢病毒载体，不仅可以作为常规RNAi载体使用，也可被包装成慢病毒颗粒，感染细胞。重组载体进入细胞后整合到基因组，便可以稳定表达shRNA，且具有Puromycin抗性，在后续实验中便于通过Puromycin筛选稳定整合shRNA的细胞系。
[0004]目前，利用慢病毒pLKO.1构建shRNA载体还未有应用于家蚕研究的报道，在家蚕中还未发现长效稳定的干扰载体，这对于家蚕基因功能的研究进展造成了一定的阻碍。
技术实现思路
[0005]专利技术目的：本专利技术的第一目的是提供一种可以干涉家蚕Bmp53基因的shRNA；
[0006]本专利技术的第二目的是提供包含所述shRNA的表达盒、重组载体、重组病毒、重组细胞或重组菌；
[0007]本专利技术的第三目的是提供包含所述shRNA的重组载体的构建方法；
[0008]本专利技术的第四目的是提供一种由所述shRNA干涉家蚕Bmp53基因的方法。
[0009]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种家蚕Bmp53基因的shRNA，包括正义链和反义链，shRNA正义链的核苷酸系列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中所示的一种或几种，shRNA反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中所示的一种或几种。
[0010]以下为设计shRNA的基本原则：
[0011](1)从起始密码ATG下游25个核苷酸后开始，寻找21个核苷酸，排列模式符合AA
(N19)。如果没有符合上述模式的序列，可以寻找符合NAR(N17)YNN这种排列模式。N为任一核苷酸，R为嘌呤，Y为嘧啶；
[0012](2)GC含量为36％～52％；
[0013](3)正义链3
’
端稳定性较低，在15～19核苷酸位置，至少有一个A或T；
[0014](4)避免靶向内含子；
[0015](5)避免21个核苷酸内有连续4个或更多重复的核苷酸，尤其避免重复的T，因为重复的T可以导致RNA聚合酶Ⅲ转录终止。
[0016]为避免脱靶效应，利用NCBI的BLAST程序进行同源性搜索的同时，设计了6条序列靶向Bmp53基因，一是为了测试比较shRNA的敲降效率，二是为了避免脱靶。
[0017]本
技术实现思路
还包括含有所述shRNA的表达盒、重组载体、重组细胞或重组菌。
[0018]本
技术实现思路
还包括所述shRNA、包含所述shRNA的表达盒、重组载体、重组病毒、重组细胞或重组菌在干涉家蚕Bmp53基因中的应用。
[0019]优选的，所述重组载体为pLKO.1
‑
puro载体，所述重组载体也可以为其他的慢病毒载体。
[0020]本
技术实现思路
还包括含有所述shRNA的重组载体的构建方法，包括以下步骤：
[0021](1)将所述shRNA插入克隆载体；
[0022](2)筛选阳性克隆载体即为重组载体。
[0023]本专利技术还包括所述的重组病毒的获得方法，包括以下步骤，将所述重组载体和pspAX2、pMD2.G质粒包装成病毒颗粒转染细胞即得。
[0024]本
技术实现思路
还包括一种由shRNA干涉家蚕Bmp53基因的方法，包括以下步骤，用所述重组病毒感染家蚕。
[0025]有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下显著优点：(1)公开了由慢病毒介导的靶向基因shRNA干扰家蚕功能基因表达的方法，设计有效干扰家蚕功能基因复制的靶向shRNA，并通过慢病毒载体插入供体细胞基因组，获得有效阻止基因表达并具有感染能力的家蚕细胞系，而后用病毒液注射家蚕，从而实现个体水平有效持续的基因敲降；(2)采用体外构建能够表达shRNA的载体，然后转入细胞内转录shRNA的策略，不仅对基因表达抑制效果明显，且稳定整合表达载体的细胞并应用到个体水平，开发了家蚕乃至鳞翅目昆虫基因功能研究的新工具，并以期用于害虫生物防治。
附图说明
[0026]图1为pLKO.1
‑
puro酶切胶图；
[0027]图2为pLKO.1
‑
puro
‑
shRNA载体示意图；
[0028]图3为BmN细胞感染病毒后状态；
[0029]图4为慢病毒载体pLKO.1
‑
puro介导的RNA干扰在家蚕细胞的基因敲降效果；
[0030]图5为慢病毒载体pLKO.1
‑
puro介导的RNA干扰在家蚕个体的基因敲降效果；
[0031]图6为家蚕个体感染病毒后生长发育情况。
具体实施方式
[0032]下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步说明。
[0033]一、设计靶向Bmp53基因的shRNA序列
[0034]以家蚕凋亡调控基因Bmp53(GenBank：HM773025.1)为靶基因，使用在线软件BLOCK
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iT
TM RNAi Designer筛选合适的含有21个碱基的靶序列。为避免脱靶效应，利用NCBI的BLAST程序进行同源性搜索的同时，设计了6条序列，一是为了测试比较shRNA的敲降效率，二是为了避免脱靶。
[0035]二、合成shRNA
[0036]确定的6个靶序列，将靶序列插入如下基本骨架，序列如表1所示。
[本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种家蚕Bmp53基因的shRNA，其特征在于，所述shRNA包括正义链和反义链，所述shRNA正义链的核苷酸系列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6中所示的一种或几种，所述shRNA反义链的核苷酸序列选自SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中所示的一种或几种。2.表达盒、重组载体、重组病毒、重组细胞或重组菌，其特征在于，其含有权利要求1所述的shRNA。3.权利要求1所述的家蚕Bmp53基因的shRNA、权利要求2所述的表达盒、重组载体、重组病毒、重...
【专利技术属性】
技术研发人员：王梅仙，罗雨涵，樊炳炎，阿依努尔，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：
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