【技术实现步骤摘要】
小RNA文库测序过程中去除接头自连产物的方法
[0001]本专利技术涉及生物
，特别是基因测序领域。具体地，本专利技术涉及去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法。更具体地，本专利技术涉及利用内切酶去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法，基于小RNA样本构建测序文库的方法，构建小RNA测序文库的试剂盒和确定小RNA分子的序列信息的方法。
技术介绍
[0002]小RNA是生物体内的一大类调控分子，包括miRNA、siRNA、piRNA、snRNA、snoRNA、srRNA等，它们在生物体内发挥着重要的调控作用。近些年已有一些研究成功地将小RNA的谱系作为特定疾病诊断的标志物。未来小RNA的检测将会在疾病的早期诊断、分型和个体化检测治疗中得到广泛地应用。常用的小RNA定量检测技术包括深度测序技术、芯片技术和qRT
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PCR技术。后两者需要合成特异性探针，因此只能检测已知种类的小RNA。高通量测序技术因其具有通量高、灵敏度高、无需任何预先的序列信息以及二级结构信息、可以发现新的小RNA分子等优点在小RNA研究领域得到广泛应用。对于小RNA深度测序的文库构建方法主要是两步接头连接反转录法。该方法适用于包括打断的长转录本RNA在内的任何适合连接反应的RNA深度测序文库的构建，例如小RNA测序、CLIP测序、RIP测序、GRO测序等。
[0003]小RNA测序由于技术上的限制，现有小RNA或RNA片段的文库构建方法仍较难对微量样品(低于100ng总RNA或1ng小RNA)中的小RNA进行检测...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种针对含DNA样本的样本处理方法，所述DNA样本中包含DNA
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RNA
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DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链，所述方法包括在所述DNA样本中加入DNA内切酶，所述DNA内切酶能够有效切割含有其识别位点序列的双链DNA，而对含有所述识别位点序列的RNA:cDNA杂合链具有低活性，所述DNA
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RNA
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DNA:cDNA杂合链的RNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，所述DNA:cDNA双链的DNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，可选地，所述DNA
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RNA
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DNA:cDNA杂合链产生于RNA测序文库的构建过程中；可选地，DNA:cDNA双链中的DNA为RNA测序文库构建过程中使用的5
’
端接头和3
’
端接头形成的自连产物。2.一种去除RNA测序文库构建时产生的5
’
接头和3
’
接头自连产物的方法，或构建RNA测序文库的方法，其包括以下步骤：(1)在样本RNA分子的3
’
末端连接所述3
’
端接头；(2)在所述连接有3
’
端接头的样本RNA分子的5
’
末端连接所述5
’
端接头；(3)利用延伸引物，基于所述连接有3
’
端接头和5
’
端接头的样本RNA分子，利用延伸酶获得延伸产物；(4)使用DNA内切酶对所述延伸产物进行酶切处理，去除体系中的所述接头自连产物；(5)进行PCR扩增，所得扩增产物即为测序文库。其中，所述5
’
端接头和所述3
’
端接头均含有所述DNA内切酶的识别位点的部分序列，在形成所述自连产物时，在所述5
’
端接头和所述3
’
端接头的连接处形成完整的识别位点序列；可选地，所述样本RNA分子为小RNA分子；优选地，所述小RNA分子的长度为15
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200nt；可选地，所述样本RNA分子的含量为≥50pg；优选地，所述样本RNA分子的量为50pg
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20ng。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链的切割效率为对于相应DNA:cDNA双链的切割效率的至多1/10，至多1/100，至多1/1000，至多1/10000，所述DNA:cDNA双链含有相同序列的cDNA以及与其互补的DNA；优选的，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链无活性，或无能够检测到的活性。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，步骤(1)的连接反应使用截断型T4 RNA连接酶2作为连接酶。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中，所述3
’
端接头和所述5
’
端接头分别带有所述DNA内切酶的识别位点序列30％以上，优选40％以上，更优选50％的序列，且在形成所述自连产物时，在所述5
’
端接头和所述3
’
端接头的连接处形成完整的识别位点序列。6.根据权利要求2
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5中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中使用的延伸酶是逆转录酶或Bst聚合酶。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中，所述DNA内切酶是双链DNA内切酶；优选地，所述DNA内切酶选自下组：AatII，BamHI，BsaBI，BsrFI，DraI，HphI，NdeI，PauI，PvuII，SwaI，Acc65I，BanI，BsaHI，BsrGI，DraIII，Hpy188I，NgoMI，RsaI，TaqI，AccI，BanII，BsaI，BsrI，DrdI，Hpy188III，NheI，RsrII，TfiI，AciI，BbsI，BsaJi，BssHI，BssHII，EaeI，Hpy99I，
NlaIII，SacI，TliI，AclI，BbvCI，BsaWI，BssKI，EagI，HpyCH4III，NlaIV，SacII，TseI，AcuI，BbvI，BsaXI，BssSI，EarI，HpyCH4IV，NotI，SalI，Tsp45I，AfeI，BccI，BseRI，BstAPI，EciI，HpyCH4V，NruI，SapI，Tsp509I，AflII，BceAI，BseYI，BstBI，EcoNI，KasI，NsiI，Sau3AI，TspRI，AflIII，BcgI，BsgI，BstEII，EcoO109I，KpnI，NspI，Sau96I，Tth111I，AgeI，BciVI，BsiEI，BstF5I，EcoRI，MboI，PacI，SbfI，XbaI，AhdI，BclI，BsiHKAI，BstNI，EcoRV，MboII，PaeR7I，ScaI，XcmI，AleI，BfaI，BsiWI，BstUI，FatI，MfeI，PciI，ScrFI，XhoI，AluI，BfrBI，BsiI，BstXI，FauI，MluI，PflFI，SexAI，XmaI，AlwI，BfuAI，BsmAI，BstYI，Fnu4HI，MlyI，PflMI，SfaNI，XmnI，AlwNI，BfuCI，BsmBI，BstZ17I，FseI，MmeI，PhoI，SfcI，ZraI，ApaI，BglI，BsmFI，Bsu36I，FspI，MnlI，PleI，SfoI，ApaLI，BglII，BsmI，BtgI，HaeII，MscI，PmeI，SgrAI，Nb.BbvCI，ApeKI，BlpI，BsoBI，BtgZI，HaeIII，MseI，PmlI，SmaI，Nt.BbvCI，ApoI，Bme1580I，Bsp1286I，BtsI，HgaI，MsiI，PpuMI，SmlI，Nb.BsmI，AscI，BmgBI，BspCNI，Cac8I，HhaI，MspA1I，PshAI，SnaBI，Nt.BstNBI，AseI，BmrI，BspDI，ClaI，HincII，MspI，PsiI，SpeI，AsiSI，BmtI，BspE...
【专利技术属性】
技术研发人员：马士清，刘军，陈一友，
申请(专利权)人：杭州诺辉健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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