引物探针组、试剂盒及其用途制造技术

本发明专利技术涉及基因检测技术领域，具体涉及一种引物探针组、试剂盒及其用途。本发明专利技术提供的引物探针组包括第一引物探针组和第二引物探针组以及任选地第三引物探针组。本发明专利技术还提供了包含该引物探针组的试剂盒。本发明专利技术提供的引物探针组或试剂盒可用于检测HLA

【技术实现步骤摘要】
引物探针组、试剂盒及其用途


[0001]本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种引物探针组及其在检测HLA
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B*35:01等位基因中的用途，一种试剂盒及其在检测HLA
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B*35:01等位基因中的用途，以及一种检测HLA
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B*35:01等位基因的方法。

技术介绍

[0002]主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，MHC)是由一群紧密连锁的基因群组成，是早期从组织器官移植实验中发现的。人类的MHC通常称为HLA基因或HLA复合体，其编码的分子表达于白细胞上，称为人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)。丰富的多态性是HLA基因系统的一个最重要特点，HLA复合体中的许多DNA序列都存在变异体，称为等位基因。
[0003]目前检测HLA
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B*35:01等位基因的方法是PCR
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SBT、高通量测序方法以及QPCR方法。其中，PCR
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SBT即直接测序法，该方法可直接获得DNA序列，鉴定所有可能存在的多态性，为最直接的方法，同时特异性强，灵敏度高，是国际公认的HLA等位基因分型方法的“金标准”。但是该方法存在成本高、耗时长、结果分析依赖专业设备且对分析人员要求高的缺陷，同时由于目的基因序列的特殊性、引物设计等多种因素，测序结果会出现套峰，不利于结果的判读，使得PCR
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SBT法存在着模棱两可的结果。高通量测序方法同PCR
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SBT方法一样，其操作繁琐，耗费时间，测序价格昂贵等缺点已经逐渐不能满足现代医学检测“快速、简便”的特点。QPCR方法即实时荧光定量PCR，该方法实验操作相对简单，耗时也低于测序法，可用于快速分型HLA
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B*35:01。然而，现有的QPCR法在检测HLA
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B*35:01等位基因易出现假阳性的情况。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种引物探针组、试剂盒及其在用于检测HLA
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B*35:01等位基因中的用途，旨在提升对HLA
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B*35:01等位基因检测的特异性和准确性。
[0005]相应地，本专利技术第一方面，提供了一种引物探针组，其包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物、如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物以及如SEQ ID NO:3所示的第一探针；所述第二引物探针组包括如SEQ ID NO:4所示的第二上游引物、如SEQ ID NO:5所示的第二下游引物以及如SEQ ID NO:6所示的第二探针。
[0006]本专利技术第二方面，提供了所述引物探针组在用于检测HLA
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B*35:01等位基因中的用途，或者在制备用于检测HLA
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B*35:01等位基因的试剂盒中的用途。
[0007]本专利技术第三方面，提供了一种试剂盒，其包含本专利技术所述的引物探针组。
[0008]本专利技术第四方面，提供了所述试剂盒在检测HLA
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B*35:01等位基因中的用途。
[0009]本专利技术第五方面，提供了一种检测HLA
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B*35:01等位基因的方法，其包括：
[0010]提供待检测样本的基因组DNA；
[0011]将所述基因组DNA与包括第一引物探针组、第二引物探针组以及第三引物探针组的扩增反应液进行混合处理后，进行QPCR扩增反应；
[0012]当所述基因组DNA在突变位点rs105534的CT值与内参基因ACTB的CT值的差的绝对值、以及在突变位点rs697742、rs4997052和rs3179865的CT值分别与内参基因ACTB的CT值的差的绝对值均小于4时，所述基因组DNA携带有HLA
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B*35:01等位基因。
[0013]本专利技术具有如下有益效果：
[0014]本专利技术提供的引物探针组是针对HLA
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B*35:01基因的特定的突变位点组合rs1055348、rs697742、rs4997052和rs3179865，根据突变位点附近的区域，结合等位基因阻滞突变系统(ARMS)的方法进行设计得到。本专利技术提供的引物探针组用于检测HLA
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B*35:01等位基因时，可以解决HLA
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B型别区分不全面的问题，更可以实现HLA
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B*35型别内的区分。同时，本专利技术提供的引物探针组中引入了碱基错配，从而提高检测HLA
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B*35:01等位基因时的特异性。因此，本专利技术提供的引物探针组或包含该引物探针组的试剂盒可用于检测HLA
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B*35:01等位基因，具有较高的准确性和特异性，可快速高效地实现HLA
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B*35:01等位基因的检测，应用前景良好。
附图说明
[0015]图1是本专利技术实施例2的8例样本在rs1055348(第一引物探针组扩增的位点)的FAM、VIC双通道实时荧光扩增结果图；
[0016]图2为本专利技术实施例2的8例样本在rs697742、rs4997052和rs3179865(第二引物探针组扩增的位点)的ROX、VIC双通道实时荧光扩增结果图；
[0017]图3为对比例在HLA
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B*35:01等位基因检测的FAM、VIC双通道实时荧光扩增结果图；
[0018]图4为本专利技术实施例3的准确性验证实验中，在rs1055348的FAM、VIC双通道实时荧光扩增结果图；
[0019]图5为本专利技术实施例3的准确性验证实验中，在rs697742、rs4997052和rs3179865的ROX、VIC双通道实时荧光扩增结果图。
具体实施方式
[0020]本专利技术实施例提供了一种引物探针组，其包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物、如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物以及如SEQ ID NO:3所示的第一探针；所述第二引物探针组包括如SEQ ID NO:4所示的第二上游引物、如SEQ ID NO:5所示的第二下游引物以及如SEQ ID NO:6所示的第二探针。
[0021]本专利技术实施例提供的引物探针组是针对HLA
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B*35:01基因的特定的突变位点组合rs1055348、rs697742、rs4997052和rs3179865而设计的特异性引物探针组。其中，rs1055348、rs697742、rs4997052和rs3179865为单核苷酸多态性数据库中的ID号。本专利技术实施例选取的突变位点，一组(rs1055348)用于35型别与其他型别的区分，另一组位点(rs697742、rs4997052和rs3179865)是针对35型本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物探针组，其特征在于，所述引物探针组包括第一引物探针组和第二引物探针组，所述第一引物探针组包括如SEQ ID NO:1所示的第一上游引物、如SEQ ID NO:2所示的第一下游引物以及如SEQ ID NO:3所示的第一探针；所述第二引物探针组包括如SEQ ID NO:4所示的第二上游引物、如SEQ ID NO:5所示的第二下游引物以及如SEQ ID NO:6所示的第二探针。2.根据权利要求1所述的引物探针组，其特征在于，所述第一探针和/或所述第二探针为Taqman探针。3.根据权利要求2所述的引物探针组，其特征在于，所述第一探针和所述第二探针的5'端标记有不同的荧光基团，3'端标记有不同的淬灭基团；优选地，所述荧光基团选自FAM、ROX、CY5，所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2。4.根据权利要求1
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3任一项所述的引物探针组，其特征在于，所述引物探针组还包括用于特异性检测内参基因ACTB的第三引物探针组，所述第三引物探针组包括如SEQ ID NO:7所示的第三上游引物、如SEQ ID NO:8所示的第三下游引物以及如SEQ ID NO:9所示的第三探针。5.根据权利要求4所述的引物探针组，其特征在于，所述第三探针的5'端标记有荧光基团...

【专利技术属性】
技术研发人员：费云舟，李玉婧，彭亚丽，李超鹏，欧阳冬生，李晓晖，
申请(专利权)人：长沙都正医学检验有限责任公司，
类型：发明
国别省市：