一种山桐子的组织培养方法技术

本发明专利技术公开了一种山桐子的组织培养方法，属于山桐子组织培养技术领域，所述组织培养方法如下：(1)外植体选择：取山桐子幼嫩带芽枝条作为外植体，并对外植体进行预处理；(2)芽诱导培养：将外植体切成0.5cm大小后进行处理，然后接种到芽诱导培养基中进行芽诱导培养，待萌发出的小芽生长高度达到1

【技术实现步骤摘要】
一种山桐子的组织培养方法


[0001]本专利技术涉及山桐子组织培养
，尤其涉及一种山桐子的组织培养方法。

技术介绍

[0002]山桐子，又名油葡萄，属大风子科山桐子属高大落叶乔木，树形优美，秋日果实深红色，花单性，雌雄异株或杂性，圆锥状下垂，是优良的园艺观赏树种。山桐子单株产果量高，全果含油，油脂品质高，兼具多种保健功能，是重要的木本油料物种，被誉为树上“油仓”。
[0003]山桐子目前的繁殖方法主要有扦插繁殖，种子繁殖以及组织培养，扦插繁殖法愈伤组织发育良好，但是周期长，繁殖系数低，每年只能增殖1～3倍；种子繁殖法繁殖量大，速度快，但是不能分辨雌雄、品种纯度不高，很容易出现变种；采用组织培养能在短期内提供大量优质穗条和种苗，以保护其种质资源，为山桐子的优良品种的培育及种源基地培育建设提供种苗保障，但是目前山桐子组织培养过程中，外植体伤口处会分泌酚类化合物，其性质很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速生成褐色的醌类物质和水，醌类物质与外植体组织中的蛋白质发生聚合，引起其他酶系统失活，导致植物组织新陈代谢紊乱，进而造成植株生长状况低下，成活率降低。
[0004]因此，目前急需一种山桐子组织培养方法，解决山桐子组织培养过程中因植物组织新陈代谢紊乱造成植株生长状况低下、成活率降低的问题。

技术实现思路

[0005]鉴于此，本专利技术的目的是提供一种山桐子组织培养方法，解决山桐子组织培养过程中因植物组织新陈代谢紊乱造成植株生长状况低下、成活率降低的问题。/>[0006]本专利技术通过以下技术手段解决上述技术问题：
[0007]一种山桐子的组织培养方法，所述组织培养包括以下步骤：
[0008](1)外植体选择：于3
‑
4月份采取生长健壮、无病虫害的山桐子优良单株的幼嫩带芽枝条作为外植体，保湿带回实验室，放在水里进行水培，水培期间用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体进行预处理，每天喷1次，连续喷3天，然后对外植体进行消毒处理；
[0009](2)芽诱导培养：用镊子将消毒后的外植体切成0.5cm大小后进行低温和二氧化碳处理，然后接种到芽诱导培养基中进行芽诱导培养，并每隔12小时喷洒一次稳定剂，持续喷洒8天，20天后开始出现愈伤组织，带芽茎段侧芽萌发，待萌发出的小芽生长高度达到1
㎝
后，转接进行增殖培养；
[0010](3)增殖培养：将诱导出的小芽接种到增殖培养基上培养25天，形成芽的丛生植株；
[0011](4)瓶外生根：将生根基质放到灭菌高压锅内120℃高压灭菌30min，冷却后装入孔穴盘中；于芽的丛生植株中选取2
㎝
的单芽，将单芽用1000ppm生根粉处理30s，然后用镊子
将单芽插入穴盘中，每个穴盘扦插一个单芽，然后置于温度为25℃，湿度为85％的温室中进行培养，穴盘上面用塑料盒保温，20天后生根，生根后再放置15天，然后移出温室在室外培养。
[0012]进一步，所述步骤(1)中外植体消毒具体操作如下：
[0013]将高锰酸钾溶液预处理后的外植体用70％的酒精浸泡30s，然后用无菌水冲洗2
‑
3次，然后置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡3～5分钟，再用无菌水冲洗4
‑
5次。
[0014]进一步，所述步骤(2)中芽诱导培养基为：MS+噻苯隆(TDZ)0.2mg/L+α
‑
萘乙酸(NAA)1mg/L+细胞分裂素(6
‑
BA)0.2mg/L+激动素(KT)0.5mg/L。
[0015]进一步，所述步骤(2)中低温和二氧化碳处理的具体操作为：将外植体放入玻璃瓶中，通入二氧化碳后密封处理10
‑
20min，然后取出外植体置于4℃温度下处理10
‑
15min。
[0016]进一步，所述步骤(2)中稳定剂包括以下重量份原料：
[0017]7‑
10份菌发酵液、0.3
‑
0.5份醋酸铅、1
‑
3份硫化铵、2
‑
3份对氨基苯甲酸乙酯、2
‑
3份硼氢化钾。
[0018]进一步，所述稳定剂的制备方法如下：
[0019]A、向对氨基苯甲酸乙酯中加入75％乙醇溶液，然后在50
‑
60℃的温度下水浴加热8
‑
10min，水浴加热完成后在室温条件下静置12h后得到对氨基苯甲酸乙酯混合液备用；
[0020]B、将醋酸铅、硫化铵、硼氢化钾混合后加入水搅拌均匀，然后加入对氨基苯甲酸乙酯混合液，500
‑
800r/min的速率下高速搅拌5
‑
7min，常温静置3
‑
5h后加入菌发酵液混合均匀得到稳定剂。
[0021]进一步，所述菌发酵液为山桐子内生菌发酵培养得到的菌发酵液，具体制备方法如下：
[0022]采摘新鲜山桐子叶在无菌水下冲洗3min，冲洗完成后用75％乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗1次，再用10wt％次氯酸钠溶液浸泡15min，然后用无菌水冲洗5次；用无菌滤纸吸干叶片表面水分，然后将叶片剪成0.5cm
×
0.5cm大小后接种到PDA固体培养基中于25
‑
28℃下培养，在叶片周围长出菌落后挑出菌株放入装有PD培养液的培养瓶中，置于摇床中25
‑
28℃、150r/min培养15
‑
20天，然后离心分离去除沉淀得到菌发酵液。
[0023]进一步，所述稳定剂的喷洒量为2
‑
3g/株。
[0024]进一步，所述步骤(3)中增殖培养基为：MS+噻苯隆(TDZ)0.7mg/L+α
‑
萘乙酸(NAA)0.3mg/L+细胞分裂素(6
‑
BA)0.5mg/L。
[0025]进一步，所述步骤(4)中生根基质由蛭石和珍珠岩按照体积比3：1的比例组成。
[0026]在山桐子的组织培养过程中，外植体由于受到机械损伤，其伤口处会分泌酚类化合物，这些物质在多酚氧化酶的催化作用下被氧化成醌类物质，醌类物质会与外植体中的蛋白质聚合，造成酶系统失活，导致植物组织新陈代谢紊乱，进而造成植株生长状况低下，成活率低，因此在组织培养过程中需要对外植体进行处理，保证酶系统的活性，维持山桐子组织正常的新陈代谢，提高其成活率和生长状况；
[0027]将外植体放入玻璃瓶中，通入二氧化碳处理后再进行低温处理，可减少醌类物质的形成，这是由于二氧化碳可降低外植体的呼吸作用，进而抑制多酚氧化酶的活性，且多酚氧化酶在低温条件下时，其活性大大降低，进而其催化酚类物质形成醌类物质的作用降低，减少了醌类物质的形成，但是外植体不能长时间放置于二氧化碳和低温环境中，当其离开
二氧化碳和低温环境时，多酚氧化酶的活性恢复，外植体中的酚类物质会再被氧化生成醌，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种山桐子的组织培养方法，其特征在于，所述组织培养包括以下步骤：(1)外植体选择：于3
‑
4月份采取山桐子优良单株的幼嫩带芽枝条作为外植体，保湿带回实验室，放在水里进行水培，水培期间用质量浓度为0.1％的高锰酸钾溶液喷洒外植体进行预处理，每天喷1次，连续喷3天，然后对外植体进行消毒处理；(2)芽诱导培养：用镊子将消毒后的外植体切成0.5cm大小后进行低温和二氧化碳处理，然后接种到芽诱导培养基中进行芽诱导培养，并每隔12小时喷洒一次稳定剂，持续喷洒8天，20天后开始出现愈伤组织，带芽枝条侧芽萌发，待萌发出的芽生长高度达到1
㎝
后，转接进行增殖培养；(3)增殖培养：将诱导出的小芽接种到增殖培养基上培养25天，形成芽的丛生植株；(4)瓶外生根：将生根基质放到灭菌高压锅内120℃高压灭菌30min，冷却后装入孔穴盘中；于芽的丛生植株中选取2
㎝
的单芽，将单芽用1000ppm生根粉处理30s，然后用镊子将单芽插入穴盘中，每个穴盘扦插一个单芽，然后置于温度为25℃，湿度为85％的温室中进行培养，穴盘上面用塑料盒保温，20天后生根，生根后再放置15天，然后移出温室在室外培养。2.根据权利要求1所述的一种山桐子的组织培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中外植体消毒具体操作如下：将高锰酸钾溶液预处理后的外植体用70％的酒精浸泡30s，之后用无菌水冲洗2
‑
3次，然后置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡3～5分钟，再用无菌水冲洗4
‑
5次。3.根据权利要求1所述的一种山桐子的组织培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中芽诱导培养基为：MS+TDZ 0.2mg/L+NAA 1mg/L+6
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BA 0.2mg/L+KT0.5mg/L。4.根据权利要求1所述的一种山桐子的组织培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中低温和二氧化碳处理的具体操作如下：将外植体放入玻璃瓶中，通入二氧化碳后密封处理10
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20min，然后取出外植体置于4℃温度下处理10
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15min。5.根据权利要求1所述的一种山桐子的组...

【专利技术属性】
技术研发人员：田怀，侯娜，刘小红，陈胜群，沈莲文，
申请(专利权)人：贵州省核桃研究所，
类型：发明
国别省市：