靶向ITGβ5-14-3-3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5-X及其制备方法与用途技术

本发明专利技术涉及肿瘤的靶向治疗药物领域，尤其涉及靶向ITGβ5

【技术实现步骤摘要】
靶向ITG
β5‑
14
‑3‑3ζ
复合物的抗肿瘤多肽B5
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X及其制备方法与用途


[0001]本专利技术涉及肿瘤的靶向治疗药物领域，尤其涉及靶向ITGβ5
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3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5
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X及其制备方法与用途。

技术介绍

[0002]近几十年来，随着人类平均寿命的增长、生活环境以及生活方式的改变，癌症已成为威胁人类生命健康的第一大杀手。其中胰腺癌是消化系统最致命的恶性肿瘤，预后差，死亡率高，是世界上第四大常见的癌症相关死亡原因。现有研究报告胰腺癌的主要危险因素包括高龄、吸烟、高脂肪饮食、糖尿病、慢性胰腺炎(特别是遗传性胰腺炎)和胰腺癌家族史阳性。尽管胰腺癌疾病的生物学的整体认识在不断扩大，但由于症状非特异性和缺乏早期检测方法，胰腺癌经常在晚期被诊断出来。在胰腺癌的综合治疗中，手术是主要的治疗方式，但是胰腺癌早期症状不典型、易发生转移等特点，超过80%的胰腺癌患者就诊时已经处于病灶无法根治性切除的阶段。事实上，胰腺癌患者即使接受了手术治疗，大多数胰腺癌患者死于肿瘤复发和转移，5年生存率仅为20%左右。基于吉西他滨的化疗已被用作不可切除胰腺癌患者的标准治疗，然而，常规应用单药或多药联用的化疗方案并未大幅度改善胰腺癌患者的预后。其他治疗方法如去间质治疗、基因治疗以及分子靶向治疗等，大多处于临床试验阶段，尚无强有力的证据证实其临床疗效。胰腺癌的发病是个复杂的多阶段发展的过程，是由多个肿瘤基因和分子之间协调作用共同导致了肿瘤细胞的形成和发展。因此，亟需对胰腺癌发生发展过程中关键分子及分子机制进行更深入的研究，寻找潜在的抗胰腺癌治疗新靶点，并为临床治疗胰腺癌提供新的方法和思路。
[0003]整合素是一个大型跨膜糖蛋白受体家族，由非共价连接的α亚基和β亚基组成的异源二聚体。通常大多数α亚基仅能与一种特异性的β亚基固定结合，但有些α亚基能够识别并结合多种不同的β亚基。不同的异源二聚体组合具有配体结合的特异性，可与其他分子的识别、粘附和结合，作为双向信号转导介质介导细胞内外的信息传递。在正常情况下，整合素在上皮细胞中均有表达并且执行其正常的生理功能，如参与调节细胞粘附、扩散、迁移、生存和分化等关键发育过程。然而，许多实体肿瘤起源于上皮细胞，这一恶性转变过程伴随着细胞整合素分子表达水平的改变，并且随着组织类型和进展程度的不同而存在差异。产生这一现象的原因，可能是某一种致癌基因表达异常后，直接增加某一整合素的活性或降低其他整合素的活性造成的；或者，鉴于转移性癌细胞往往需要适应肿瘤微环境的选择性压力，肿瘤细胞选择性地削弱使其维持在静息和分化状态的整合素分子，而强化有助于肿瘤细胞生存和转移的整合素分子。此外，整合素和整合素依赖的生物学过程在介导肿瘤的形成、生长、耐药和复发中起着重要作用。
[0004]整合素β5属于整合素β亚基，仅与αV亚基组合，可结合到细胞外基质（ECM）结构蛋白上的不同生物活性区域，以提供细胞骨架的机械稳定性，并启动细胞质信号级联。目前，大量的研究表明，ITGβ5异常表达在多种恶性肿瘤的起始和进展中发挥着重要功能。ITGβ5
被确定为骨肉瘤细胞中Hippo通路的负调控因子，过表达ITGβ5的骨肉瘤患者有较高的肺转移风险。在我们的前期研究结果中，ITGβ5在胰腺癌组织中表达显著上调，并与肿瘤分化程度，pT 分期，pN 分期，毗邻脏器浸润，pTNM 分期等较差的临床病理参数和不良预后密切相关。此外，ITGβ5高表达促进了胰腺癌细胞生长和转移等多种生物学行为，加速了胰腺癌恶性进展。由于在不同癌细胞之间存在较大异质性，致使ITGβ5影响癌症进展的分子机制更加复杂。在卵巢癌和宫颈癌中，上调ITGβ5可促进FAK的磷酸化，进而诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化，促进肿瘤细胞的侵袭和迁移，从而加剧疾病进展。而在乳腺癌和宫颈癌细胞中，ITGβ5过表达激活粘着斑信号通路，导致糖酵解代谢进程紊乱，进而诱导肿瘤细胞对顺铂产生耐药性。此外，ITGβ5通过活化转化生长因子(TGF)
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β/Smad信号转导通路，促进结直肠癌细胞发生上皮
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间质转化。然而，在癌症细胞中，ITGβ5表达水平的异常升高可能是由转录后或翻译后过程失调引起的。MiR
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185作为肝细胞癌中的关键抑制因子，其表达发生显著下调，致使下游靶基因ITGβ5在肿瘤细胞中表达增加，通过增强β
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连环蛋白的稳定性来促进肿瘤细胞的生长和迁移。 Huang等人研究结果表明，c
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Met可能通过ITGβ5与KRT16部分结合，这三个蛋白可能共定位形成稳定的复合物，促进c
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Met和ITGβ5介导的OSCC细胞信号转导。
[0005]至今为止，已经有多种以整合素作为药物靶点的针对不同疾病的抑制剂进行临床试验。Etaracizumab（MEDI
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522），一种针对整合素ανβ3的靶向药物，抑制肿瘤血管生成和肿瘤细胞生长。人αν整合素特异性单克隆抗体intetumumab (CNTO
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95)，同时靶向整合素ανβ3和ανβ5，在移植瘤模型中也显示出抗肿瘤和抗血管生成作用。ATN
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161（整合素ανβ1拮抗剂）以及Volociximab，一种阻断整合素α5β1功能的单克隆抗体，已被证明可以抑制体外血管生成和小鼠肿瘤生长。西仑吉肽（Cilengitide）是一种含RGD的环状五肽，被认为是αvβ3和αvβ5整合素介导的细胞
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基质相互作用的选择性抑制剂。在许多体内模型中，西仑吉肽已被证明具有抗癌活性，包括抑制肿瘤细胞的侵袭和转移以及全面抑制血管生成。在CENTRIC临床试验中，肿瘤或内皮细胞中靶整合素的差异表达与西伦吉肽治疗的结果无关。然而，这种治疗策略在临床试验中遇到了挑战，无论是单独使用还是与放化疗联用，整合素选择性抑制剂均未达到预期效果，需进一步研究和开发更有效的整合素特异性靶向药物。
[0006]蛋白质通常以蛋白质复合物的形式在体内发挥关键作用，也称为蛋白
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蛋白相互作用（Protein
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protein interaction, PPI）。PPI分析有助于从系统的角度研究疾病的分子机制，发现新的药物靶点，称为当前的热点研究方向。已建立的蛋白质
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蛋白质相互作用实验的策略包括:免疫沉淀（IP）与随后的Western blotting或基于质谱的结合伙伴识别、谷胱甘肽
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转移酶（GST）
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融合蛋白拉下（PD）、酵母双杂交、荧光共振能量转移（FRET）、蓝色天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN
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PAGE）等。首先，我们通过免疫沉淀的方式富集胰腺癌细胞中与ITGβ5相互作用的蛋白分子，SDS
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PAGE凝胶电泳分离共沉淀的蛋白质，后续执行蛋白质谱分析（LC/MS），获取胰腺癌细胞中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向ITGβ5
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3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5
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X，其特征在于：所述多肽氨基酸序列如下所示：ELDGDVNGHKFVEGE。2.根据权利要求1所述的一种靶向ITGβ5
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3ζ复合物的抗肿瘤多肽B5
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X的制备方法，包括如下步骤：1）、称取RINK树脂3 g(取代度0.3 mmol/g）于150 ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷（DCM）浸泡；2）、2小时后，用3倍树脂体积的氮
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二甲基甲酰胺（DMF）洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用；3）向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF），放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团，脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干；4）、取少量树脂用茚三酮（九井水合茚三酮）法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功；5）、称取C端第一个氨基酸适量和1
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羟基
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苯骈三唑（HOBT）适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N
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二异丙基碳二亚胺（DIC）振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；6）、2小时后，用一定量的醋酸酐封头（醋酸酐：DIEA : DCM=1：1：2)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用；7）、向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF=1:4），放在脱色摇床上摇晃20 min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团，脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干；8）、取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮）法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），树脂有颜色，说明脱保护成功；9）、称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50 ml的离心管中，加入25 ml的DMF将其溶解，然后加入2.5 ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应；10）、1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测（检A、检B各两滴，100℃反应1min），若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应；11）、待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20%哌啶（哌啶/DMF=1:4），放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团，脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去；12）、按照步骤9）
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11）依次接剩余的氨基酸；13）、待接...

【专利技术属性】
技术研发人员：李策，曲秀娟，车晓芳，郭小会，侯科佐，张晓洁，
申请(专利权)人：中国医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：