一种重组肉毒杆菌神经毒素及其制备方法和应用技术

一种重组肉毒杆菌神经毒素及其制备方法和应用，属于生物工程技术领域，重组肉毒杆菌神经毒素的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。本发明专利技术的一种重组肉毒杆菌神经毒素，其插入外源蛋白酶识别位点，有效提高对单链多肽的切割效率，得到具有较高生物活性的双链形式BoNT/A。本发明专利技术的一种双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法，通过高效切割所述的重组肉毒杆菌神经毒素制得双链式肉毒杆菌神经毒素。进一步地，在大肠杆菌中定量等比表达单链形式重组肉毒杆菌神经毒素和外源蛋白酶，外源蛋白酶可在大肠杆菌中切割单链形式重组肉毒杆菌神经毒素产生活性形式的双链式肉毒杆菌神经毒素，从而实现利用大肠杆菌进行一步生产。现利用大肠杆菌进行一步生产。现利用大肠杆菌进行一步生产。

【技术实现步骤摘要】
一种重组肉毒杆菌神经毒素及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种重组肉毒杆菌神经毒素及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肉毒杆菌神经毒素(BoNT)是一类由肉毒杆菌(Clostridium Botulinum)所产生的蛋白质毒素，它十分特异地靶向神经细胞，是自然界中已知的毒性最高的毒素。该毒素家族目前已知有七种亚型，其中A型被广泛用于疾病治疗和医美领域。
[0003]A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A)在肉毒杆菌内被合成为单链多肽，该单链多肽通过蛋白水解酶在特定位点水解切割形成由二硫键连接在一起的两条多肽，该双链形式即为目标药物的活性形式。现有技术中的BoNT的生产是通过培养肉毒梭菌并随后分类和纯化梭菌神经毒素复合体来进行的。然而，以该方式生产BoNT是低效的且蛋白产量低。此外，肉毒梭菌是产芽孢细菌并因此需要专业的培养设备和装置，这些设备和装置是细菌(如大肠杆菌)培养中不需要的。因此，增多的BoNT应用导致需要替代性和/或改善的生产和纯化BoNT的方法。US 20080103098描述了一种生产双链形式重组BoNT蛋白的方法，该方法包括在大肠杆菌宿主细胞中表达重组核酸构建体。然而，所述方法需要在神经毒素的环结构域中插入特异性、非天然的(即非梭菌的)五肽序列；插入的五肽序列形成激活切割位)在细胞裂解后由内源性大肠杆菌蛋白酶切割。因此，US20080103098的方法指出，为实现优化的BoNT表达，必须通过插入非天然的切割位点对BoNT序列进行修饰。US 7132259描述了编码BoNT蛋白的重组核酸分子。然而，US 7132259的核酸分子经过修饰以使用非天然的切割位点代替天然的切割位点。因此，US 7132259的方法也指出，需要插入非天然的切割位点以进行优化的BoNT表达。以上两种方法均须通过对BoNT序列进行修饰引入非天然的切割位点才能实现具有活性的BoNT表达。
[0004]US 6495143描述了在大肠杆菌中单独表达并纯化单个H链和L链后在严格控制的条件下通过氧化型二硫键连接使H链和L链亚基结合形成活性双链BoNT的方法。然而该方法存在若干不足。具体而言，(1)难以大量表达和分离单个H链和L链，当H链不存在时，分离的L链在水溶液中完全不溶并且极易被蛋白酶水解降解。(2)单独的H链和L链在体外氧化以生成活性双链的效率不高，导致活性毒素的产量低，多数产品为无活性的非正确折叠或氧化形式的BoNT。(3)对含有正确折叠和氧化的H和L链的毒素进行纯化是困难的，将其与这些非活性形式和未反应的单独的H和L链分离也是困难的。
[0005]基于现有技术的不足，因此有必要研究一种生产具有较高生物活性的双链形式BoNT/A的方法，提高蛋白酶对单链多肽的切割效率，并降低生产成本。

技术实现思路

[0006]为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的之一在于提供一种重组肉毒杆菌神经毒素，其插入外源蛋白酶识别位点，有效提高对单链多肽的切割效率，得到具有较高生物活性
的双链形式BoNT/A。
[0007]本专利技术的目的之二在于提供一种重组肉毒杆菌神经毒素的制备方法。
[0008]本专利技术的目的之三在于提供一种双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法。
[0009]本专利技术的目的之四在于提供一种双链式肉毒杆菌神经毒素。
[0010]本专利技术的目的之五在于提供一种双链式肉毒杆菌神经毒素的应用。
[0011]本专利技术的目的之一采用如下技术方案实现：
[0012]一种重组肉毒杆菌神经毒素，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0013]进一步地，所述重组肉毒杆菌神经毒素的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO:1
‑
5所示。
[0014]本专利技术的目的之二采用如下技术方案实现：
[0015]一种重组肉毒杆菌神经毒素的制备方法，包括以下步骤：
[0016]1)将重组肉毒杆菌神经毒素的编码基因插入质粒pET
‑
15b中，得到重组pET
‑
15b质粒；
[0017]2)将重组pET
‑
15b质粒导入大肠杆菌中，培养并诱导表达，得到重组肉毒杆菌神经毒素。
[0018]进一步地，步骤2)中，具体操作为：将重组pET
‑
15b质粒导入BL21(DE3)或BL21(DE3)pLySs感受态细胞中，筛选获取表达重组肉毒杆菌神经毒素的单克隆菌株，将单克隆菌株接种至LB培养基中，培养至OD值为0.4
‑
0.6后，加入IPTG诱导剂在25
‑
37℃下诱导表达，得到重组肉毒杆菌神经毒素。
[0019]本专利技术的目的之三采用如下技术方案实现：
[0020]一种双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法，切割所述的重组肉毒杆菌神经毒素制成。
[0021]进一步地，包括以下步骤：
[0022]S101，将重组肉毒杆菌神经毒素的编码基因和外源蛋白酶插入质粒pCDFDuet
‑
1中，得到重组pCDFDuet
‑
1质粒；
[0023]S102，将重组pCDFDuet
‑
1质粒导入大肠杆菌中，培养并诱导表达，得到重组工程菌；
[0024]S103，将所述重组工程菌裂解，分离纯化，得到所述双链式肉毒杆菌神经毒素。
[0025]进一步地，所述外源蛋白酶为EV71
‑
3C蛋白。
[0026]进一步地，包括以下步骤：
[0027]S201，构建表达重组肉毒杆菌神经毒素的工程菌；
[0028]S202，将所述工程菌裂解，得到含重组肉毒杆菌神经毒素的裂解液；
[0029]S203，将所述裂解液流经固定外源蛋白酶的反应柱，分离纯化，得到所述双链式肉毒杆菌神经毒素。
[0030]本专利技术的目的之四采用如下技术方案实现：
[0031]一种双链式肉毒杆菌神经毒素，由所述的双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法制得。
[0032]本专利技术的目的之五采用如下技术方案实现：
[0033]一种所述的双链式肉毒杆菌神经毒素的应用，所述双链式肉毒杆菌神经毒素在制
备皮肤治疗药物和医美产品中的应用。
[0034]相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：
[0035]本专利技术的一种重组肉毒杆菌神经毒素，其插入外源蛋白酶识别位点，有效提高对单链多肽的切割效率，得到具有较高生物活性的双链形式BoNT/A。
[0036]本专利技术的一种双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法，通过高效切割所述的重组肉毒杆菌神经毒素制得双链式肉毒杆菌神经毒素。进一步地，在大肠杆菌中定量等比表达单链形式重组肉毒杆菌神经毒素和外源蛋白酶(EV71
‑
3C蛋白)，外源蛋白酶可在大肠杆菌中切割单链形式重组肉毒杆菌神经毒素产生活性形式的双链式肉毒杆菌神经毒素，从而实现利用大肠杆菌进行一步生产。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组肉毒杆菌神经毒素，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。2.如权利要求1所述的重组肉毒杆菌神经毒素，其特征在于：所述重组肉毒杆菌神经毒素的编码基因的核酸序列包括SEQ ID NO:1
‑
5所示。3.一种权利要求1或2所述的重组肉毒杆菌神经毒素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将重组肉毒杆菌神经毒素的编码基因插入质粒pET
‑
15b中，得到重组pET
‑
15b质粒；2)将重组pET
‑
15b质粒导入大肠杆菌中，培养并诱导表达，得到重组肉毒杆菌神经毒素。4.如权利要求3所述的重组肉毒杆菌神经毒素的制备方法，其特征在于：步骤2)中，具体操作为：将重组pET
‑
15b质粒导入BL21(DE3)或BL21(DE3)pLySs感受态细胞中，筛选获取表达重组肉毒杆菌神经毒素的单克隆菌株，将单克隆菌株接种至LB培养基中，培养至OD值为0.4
‑
0.6后，加入IPTG诱导剂在25
‑
37℃下诱导表达，得到重组肉毒杆菌神经毒素。5.一种双链式肉毒杆菌神经毒素的制备方法，其特征在于：切割权利要求1或2所述的重组肉毒杆菌神经毒素制成。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：王师亮，王江田，张彦军，刘应康，
申请(专利权)人：海雅美生物技术珠海有限公司，
类型：发明
国别省市：