利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株及构建方法技术

本发明专利技术公开了利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株及构建方法，方法：连接基因成片段glpF

【技术实现步骤摘要】
利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株及构建方法


[0001]本专利技术属于生物
具体地涉及到利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株及构建与应用。

技术介绍

[0002]希瓦氏菌MR
‑
1(Shewanella oneidensis MR
‑
1)是目前为止机制研究较为清晰的模式电活性微生物，可以将胞内电子从醌池通过内膜四血红素蛋白(CymA)和蛋白复合物(MtrABC)或导电鞭毛直接转移到电极表面。此外，其自身分泌或外源添加的氧化还原介质也可以间接介导电子转移，这赋予了其作为非平衡发酵电催化菌株的能力。但由于缺乏相关的同化酶与磷酸转移酶系统，S.oneidensis MR
‑
1难以利用甘油等廉价的底物，而更倾向于利用乳酸和丙酮酸等低分子有机酸进行代谢，也限制了其进一步发展。
[0003]乙偶姻(3
‑
羟基
‑2‑
丁酮)是一种重要的风味化合物，广泛存在于乳制品和一些水果中。由于其独特的奶油风味，常被用作黄油、奶酪、咖啡和坚果类食品的增味剂。除此之外，它是美国能源部优先开发与利用的30种平台化学品之一，可广泛应用于化妆品、制药、化学合成等行业。近年来，人们对乙偶姻的生产方法进行了大量的研究，包括化学合成和发酵生产。化学合成或发酵通常导致外消旋混合物的产生，然而手性乙偶姻对于α
‑
羟基酮等具有药学意义的化合物的生产以及液晶复合材料的合成具有重要的意义。因此，手性乙偶姻的生产逐渐受到关注。然而，在有氧条件下往往会伴随着(S)
‑
乙偶姻的生成，因此生产过程的黄金标准仍然是厌氧发酵，这既可以避免反应器补充氧气所需的成本，也增加了手性纯度。然而在厌氧发酵中由于乙偶姻比常见的底物(例如葡萄糖、甘油等)氧化程度高，使其不能作为唯一的产品合成。添加常规的厌氧电子受体如硝酸盐或硫酸盐在增加成本的同时，也会导致发酵液中电子受体还原形式的积累。因此，利用非平衡发酵原理借助电极辅助发酵生产乙偶姻引起了人们的关注。
[0004]以MFC为依托的非平衡发酵技术，可以利用阳极作为不可耗尽的末端电子受体，在厌氧条件下实现呼吸。通过对氧化还原代谢和能量守恒进行电化学控制进而合成感兴趣的产物，并避免连续的氧气供应以及混合还原副产物的产生。目前，在S.oneidensis MR
‑
1中尚未有以甘油为底物厌氧合成乙偶姻的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株。
[0006]本专利技术的第二个目的是提供上述利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株的构建方法。
[0007]本专利技术的第三个目的是提供上述利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株的应用。
[0008]本专利技术的第四个目的是提供第二种利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌
株。
[0009]本专利技术的第五个目的是提供第二种利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株的构建方法。
[0010]本专利技术的第六个目的是提供第二种利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株的应用。
[0011]本专利技术的技术方案概述如下：
[0012]利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株构建方法，包括如下步骤
[0013](1)将来源于大肠杆菌(Escherichia coil K12 MG1655)编码甘油转运蛋白的glpF基因、经过密码子优化的来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae MGH 78578编码甘油激酶的glpK基因和编码甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的glpD基因以及来源于大肠杆菌(Escherichia coil K12MG1655)编码三磷酸异构酶的tpiA基因连接成片段glpF
‑
glpK
‑
glpD
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tpiA，并连接在载体PYYDT上，得到质粒PYYDT
‑
glpF
‑
glpK
‑
glpD
‑
tpiA；
[0014](2)将质粒PYYDT
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glpF
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glpK
‑
glpD
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tpiA导入希瓦氏菌MR
‑
1中，得到甘油利用菌株MR
‑
KR；(3)将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)编码α
‑
乙酰乳酸合成酶的alsS基因和编码α
‑
乙酰乳酸脱羧酶的alsD基因融合，并连接在载体PHG13
‑
Ptet上，得到质粒PHG13
‑
Ptet
‑
alsS
‑
alsD；
[0015](4)将质粒PHG13
‑
Ptet
‑
alsS
‑
alsD导入甘油利用菌株MR
‑
KR中，得到利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株KR
‑
PHG13
‑
Ptet；
[0016]所述glpF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0017]所述glpK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0018]所述glpD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0019]所述tpiA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0020]所述载体PYYDT的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0021]所述alsS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
[0022]所述alsD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；
[0023]所述载体PHG13
‑
Ptet的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0024]上述方法构建的利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株。
[0025]上述利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株在合成乙偶姻和生物电中的应用。
[0026]第二种利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株的构建方法，包括如下步骤：
[0027](1)将来源于大肠杆菌(Escherichia coil K12 MG1655)编码甘油转运蛋白的glpF基因、经过密码子优化的来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae MGH 78578)编码甘油激酶的glpK基因和编码甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的glpD基因以及来源于大肠杆菌(Escherichia coil K12MG1655)编码三磷酸异构酶的tpiA基因连接成片段glpF
‑
glpK
‑
glpD
‑
tpiA，并连接在载体PYYDT上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株构建方法，其特征是包括如下步骤(1)将来源于大肠杆菌(Escherichia coil K12 MG1655)编码甘油转运蛋白的glpF基因、经过密码子优化的来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae MGH 78578)编码甘油激酶的glpK基因和编码甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的glpD基因以及来源于大肠杆菌(Escherichia coil K12MG1655)编码三磷酸异构酶的tpiA基因连接成片段glpF
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glpK
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glpD
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tpiA，并连接在载体PYYDT上，得到质粒PYYDT
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glpF
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glpK
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glpD
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tpiA；(2)将质粒PYYDT
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glpF
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glpK
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glpD
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tpiA导入希瓦氏菌MR
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1中，得到甘油利用菌株MR
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KR；(3)将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 168)编码α
‑
乙酰乳酸合成酶的alsS基因和编码α
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乙酰乳酸脱羧酶的alsD基因融合，并连接在载体PHG13
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Ptet上，得到质粒PHG13
‑
Ptet
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alsS
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alsD；(4)将质粒PHG13
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Ptet
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alsS
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alsD导入甘油利用菌株MR
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KR中，得到利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株KR
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PHG13
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Ptet；所述glpF基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述glpK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述glpD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述tpiA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述载体PYYDT的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述alsS基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述alsD基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述载体PHG13
‑
Ptet的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。2.权利要求1的方法构建的利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株。3.权利要求2的利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株在合成乙偶姻和生物电中的应用。4.利用甘油合成乙偶姻和生物电的希瓦氏菌菌株的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)将来源于大肠杆菌(Escherichia coil K12 MG1655)编码甘油转运蛋白的glpF基因、经过密码子优化的来源于肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae MGH 78578)编码甘油激酶的glpK基因和编码甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的glpD基因以及...

【专利技术属性】
技术研发人员：王智文，孔书田，赵俊桃，陈涛，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：