弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法及用途技术

本发明专利技术公开了弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法及用途，该方法敲除了弓形虫tRNA硫化修饰酶基因，所述弓形虫tRNA硫化修饰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述弓形虫基因敲除虫株在tRNA硫化修饰酶位点具有如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列。该基因敲除虫株具有毒力小的优点，对宿主的安全性较高，MnmA基因缺失虫株具有良好的免疫原性和免疫保护力，能提高动物对弓形虫的免疫能力，且免疫一次可提供长期有效的保护，有制备预防动物弓形虫病的基因工程疫苗的潜力。物弓形虫病的基因工程疫苗的潜力。

【技术实现步骤摘要】
弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法及用途


[0001]本专利技术涉及一种弓形虫tRNA硫化修饰酶(MnmA)基因敲除虫株的构建方法，以及使用该方法构建的弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的用途，属于生物及基因工程领域。

技术介绍

[0002]隶属于顶复门的弓形虫是一种专性的胞内寄生虫，其生活史分为在中间宿主(几乎所有温血动物)细胞内发生的无性繁殖和在终末宿主(猫科动物)肠上皮细胞内发生的无性和有性繁殖，包括速殖子、缓殖子和卵囊等多个生命阶段。弓形虫病是由弓形虫感染引起的全球性人畜共患病，全球约三分之一的人口呈弓形虫血清抗体阳性，在中国约有10％的人感染弓形虫，而在某些地区，这一比例超过60％。相关调查显示，我国绵羊、山羊、马、鸡、猪、犬、猫和牛等家畜/禽中均发现弓形虫感染，并且感染率较高。珠三角地区家养猫的弓形虫病血清阳性率高达70％，带虫率高达50％。在免疫功能正常的机体中，弓形虫病多不表现临床症状，但对于免疫力低下个体和孕妇、孕畜而言，弓形虫感染能够引起严重疾病甚至死亡。母体感染的弓形虫可以直接通过胎盘垂直传播给胎儿，进而引起妊娠期间胎儿的流产、畸形胎、早产和死胎，给人类健康和畜牧业发展造成威胁。
[0003]因此，预防弓形虫病对于人类健康和畜牧业发展均具有重要意义。目前，防治弓形虫病主要依赖药物，乙胺嘧啶和磺胺嘧啶的联合用药是临床上应用最为广泛的治疗方法，两者协同阻断叶酸的合成，抑制弓形虫生长繁殖，但该疗法对宿主的副作用明显，长期使用宿主还会产生耐药性。疫苗被认为是一种最为有效且经济的预防策略，但截至目前，没有良好的疫苗用于预防弓形虫病，因此构建具有良好免疫原性和免疫保护力的弓形虫疫苗对于人类生活健康和畜牧业的良性发展具有非常重要的价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种弓形虫硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法，该虫株由于敲除了tRNA硫化修饰酶基因，毒力减小，具有良好的免疫保护效果，有成为抗弓形虫基因工程疫苗的潜力。
[0005](1)本专利技术所述弓形虫基因敲除虫株(
△
MnmA虫株)的构建：构建pSAG1
‑
Cas9
‑
TgU6
‑
sgMnmA质粒、制备MnmA
‑
5UTR::DHFR::MnmA
‑
3UTR同源模板,共电转至出发虫株ME49，经3μM乙胺嘧啶筛选、PCR鉴定获得弓形虫基因敲除虫株
△
MnmA；
[0006](2)基因敲除虫株
△
MnmA毒力试验：以野生型虫株ME49为对照，腹腔接种7周龄雌性ICR小鼠，1
×
103个速殖子/小鼠，每组接种6只，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明感染
△
MnmA敲除株的小鼠30天内没有死亡，存活率100％。
[0007](3)不同剂量的
△
MnmA虫株对小鼠的毒力试验：7周龄雌性ICR小鼠每只分别腹腔接种1
×
104、1
×
105和1
×
106个
△
MnmA敲除虫株，每组接种6只，对照组接1
×
104个ME49速殖子/小鼠，记录30天内小鼠的存活情况。结果表明接种不同剂量的敲除株小鼠全部存活，对照组小鼠全部死亡。说明弓形虫MnmA敲除之后对小鼠的毒力下降明显。
[0008](4)
△
MnmA虫株对小鼠的免疫保护力：以1
×
103、1
×
104和1
×
105个
△
MnmA敲除株速殖子每只小鼠的感染量接种7周龄雌性ICR小鼠，每组6只。30天后对免疫过的小鼠及PBS对照组小鼠接种1
×
104个野生型虫体ME49，观察、记录小鼠死亡情况，统计小鼠60天内的死亡率。结果表明
△
MnmA虫株对小鼠抵抗野生型虫株感染具有良好的保护力，有成为基因工程疫苗的潜力。
[0009]本专利技术的另一个目的是提供上述方法构建的弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株在制备抗弓形虫基因工程疫苗中的用途。
[0010]本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供的是一种可用于预防弓形虫感染的减毒活疫苗，与出发虫株相比，MnmA基因缺失疫苗虫株在小鼠体内几乎没有致病性，对宿主的安全性较高；MnmA基因缺失虫株具有良好的免疫原性和免疫保护力，能提高动物对弓形虫的免疫能力，且免疫一次可提供长期有效的保护，有制备预防动物弓形虫病的基因工程疫苗的潜力。
附图说明
[0011]图1是敲除弓形虫MnmA基因的策略示意图。
[0012]图2是
△
MnmA的单克隆虫株PCR鉴定结果。
[0013]图3是
△
MnmA虫株对小鼠的毒力试验结果。
[0014]图4是不同剂量
△
MnmA虫株对小鼠的毒力试验结果。
[0015]图5是
△
MnmA虫株对小鼠的免疫保护力试验结果。
具体实施方式
[0016]下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。
[0017]实施例1：弓形虫
△
MnmA虫株的构建
[0018](1)出发虫株ME49
[0019]ME49是具有tRNA硫化修饰酶基因的球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，所述tRNA硫化修饰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0020](2)pSAG1
‑
Cas9
‑
TgU6
‑
sgMnmA质粒的构建
[0021]①
利用网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)设计靶向目的基因的sgRNA序列，并根据设计的序列设计gRNA引物：
[0022]上游引物gRNA
‑
MnmA
‑
F:5
’‑
AGTTGCTTCTCTGCGAGGCGAATCG
‑3’
[0023]下游引物gRNA
‑
MnmA
‑
R：5
’‑
AAACCCGATTCGCCTCGCAGAGAAG
‑3’
；
[0024]②
在灭菌PCR管中配制如下反应体系：gRNA
‑
MnmA
‑
F 4μL、gRNA
‑
MnmA
‑
R 4μL、T4 PNK 1μL、T4 PNK Buffer 1μL，gRNA引物经过梯度降温(37℃30min；95℃5min，90℃2min，85℃2min，每5℃延伸2min至25℃)，退火延伸后合成双链。
[0025]③
将实验室保存的pSAG1
‑
Cas9
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种弓形虫tRNA硫化修饰酶基因敲除虫株的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)出发虫株是具有tRNA硫化修饰酶基因的球虫目弓形虫科弓形科属的II型虫株，所述tRNA硫化修饰酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；(2)pSAG1
‑
Cas9
‑
TgU6
‑
sgMnmA质粒的构建：以pSAG1
‑
Cas9
‑
TgU6
‑
sgBbs I为模板，经Bbs I酶切，将上下游引物经梯度降温合成双链，使用Solution I连接、转化E.coil TOP10得到pSAG1
‑
Cas9
‑
TgU6
‑
sgMnmA质粒，其中，上、下游引物序列分别为：gRNA
‑
MnmA
‑
F：5
’‑
AGTTGCTTCTCTGCGAGGCGAATCG
‑3’
gRNA
‑
MnmA
‑
R：5
’‑
AAACCCGATTCGCCTCGCAGAGAAG
‑3’
；(3)MnmA
‑
5UTR::DHFR::MnmA
‑
3UTR同源模板的制备：以出发虫株的基因组为模板，设计引物，扩增MnmA
‑
5UTR和MnmA
‑
3UTR，通过增强型重组酶II将上述2个片段克隆至pBlue
‑
DHFR载体，构建重组质粒pBlue
‑
MnmA
‑
5UTR::DHFR::MnmA
‑
3UTR，利用MnmA
‑
5UTR
‑
F2、MnmA
‑
3UTR
‑
R2扩增MnmA
‑
5UTR::DHFR::MnmA
‑
3UTR同源模板，其中扩增Mnm...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜爱芳，阳毅敏，史悦，姚晨倩，陈学秋，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：