一种柑橘CsGSTU18基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种柑橘CsGSTU18基因及其应用，所述柑橘CsGSTU18基因是柑橘溃疡病的感病基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示或者在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有编码同等活性蛋白的核苷酸序列；应用方法具体包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsGSTU18基因的VIGS片段；(2)构建VIGS的表达载体；(3)VIGS表达载体转化柑橘，得到柑橘CsGSTU18基因被沉默的VIGS植株。本发明专利技术首次克隆获得柑橘CsGSTU18基因，并利用VIGS沉默降低柑橘CsGSTU18的转录水平，验证了CsGSTU18在柑橘溃疡病抗感性中的功能；获得的VIGS沉默植株的H2O2含量明显升高，对柑橘溃疡病抗性大大增强，溃疡病的发病程度显著降低，在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种柑橘CsGSTU18基因及其应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，具体而言，涉及一种柑橘CsGSTU18基因及其应用。

技术介绍

[0002]柑橘溃疡病(Citrus bacterial canker，CBC)是由地毯草黄单胞杆菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.Citri，Xcc)引起的细菌性病害，其危害当前大多数主栽柑橘品种。因此，加强对柑橘溃疡病防控研究是柑橘产业发展的迫切需求。
[0003]柑橘溃疡病的传统防控手段例如病树焚烧和农药使用等需要投入大量人力和物力，且会造成巨大环境危害。因此，柑橘溃疡病防治更多寄希望于培育抗病新种质。分子育种由于可定向、高效培育抗病新种质，目前得到快速发展和广泛应用。近年来，通过生物技术手段已获得一些抗溃疡病的柑橘资源，如过表达CsBZIP40和CsWAKL08获得的转基因晚锦橙株系(Li et al.，2019；Li et al.，2020)；基因定点编辑CsLOB1启动子获得的转基因晚锦橙株系(Peng et al.，2017)。但优质候选基因仍然匮乏，且功能和作用机制研究不深，因此，亟待有针对性地挖掘更多与柑橘溃疡病紧密相关的基因，深入解析其功能和机制，用于抗溃疡病分子育种。
[0004]谷胱甘肽
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S
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转移酶，普遍存在于动物、植物和微生物中，是一类由多个基因编码、具有多种功能的超家族酶。根据植物蛋白质的同源性和基因结构特征，GST家族分为F(Phi)、U(Tau)、T(Theta)、Z(Zeta)、L(Lambda)、DHAR、EF1Bγ和TCHQD共8个亚家族，其中F亚家族和U亚家族是植物特有的，与其他亚家族相比，其成员最多，含量也最为丰富(Jain et al.，2010)。目前植物GST蛋白已先后在玉米、拟南芥、大豆、水稻、烟草等植物中相继发现，且在植物中具有解毒、代谢物运输、胁迫调控、调控生长发育、信号传导等功能。虽然GST调控在植物病害抗性中已有部分应用，但在柑橘溃疡病领域尚未有相关研究报道。
[0005]有鉴于此，特提出本申请。

技术实现思路

[0006]本专利技术为提高柑橘对溃疡病的抗性，提供一种柑橘CsGSTU18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，首次克隆获得柑橘CsGSTU18基因，并通过将柑橘CsGSTU18基因的VIGS载体转到柑橘中，降低柑橘CsGSTU18的转录水平，能够显著提高柑橘对溃疡病的抗性，降低溃疡病的发病程度，并且不影响转基因植株的表型。
[0007]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0008]一种柑橘CsGSTU18基因，所述柑橘CsGSTU18基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示或者在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有编码同等活性蛋白的核苷酸序列。
[0009]本专利技术还提供一种柑橘CsGSTU18基因在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，应用方法为降低柑橘属植物中CsGSTU18基因的转录水平。
[0010]进一步的，降低柑橘属植物中CsGSTU18基因转录水平的方式采用VIGS沉默。
[0011]进一步的，应用方法具体包括以下步骤：
[0012](1)克隆柑橘CsGSTU18基因的VIGS片段；
[0013](2)构建VIGS的表达载体；
[0014](3)VIGS表达载体转化柑橘，得到柑橘CsGSTU18基因被沉默的VIGS植株。
[0015]进一步的，步骤(1)中，柑橘CsGSTU18基因的VIGS片段的克隆方法为：提取柑橘总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板用高保真酶PCR扩增得到柑橘CsGSTU18基因的VIGS片段，核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。
[0016]进一步的，步骤(1)中，PCR扩增所用的引物为CsGSTU18
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VIGS
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F和CsGSTU18
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VIGS
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R，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。
[0017]进一步的，步骤(2)中，VIGS基因片段表达载体的构建方法为：将步骤(1)获得的PCR产物柑橘CsGSTU18基因的VIGS片段经Xba I和Sma I酶切，回收后与相同酶切的TRV2载体连接并转化大肠杆菌感受态细胞，提取质粒，得到CsGSTU18基因的VIGS表达载体。
[0018]进一步的，步骤(3)中，VIGS表达载体转化柑橘的方法为：将步骤(2)获得的VIGS表达载体转化农杆菌，制备含VIGS表达载体的农杆菌菌液，侵染柑橘无菌幼苗，经荧光观察、PCR和qRT
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PCR验证后得到柑橘CsGSTU18基因被沉默的VIGS植株。
[0019]进一步的，步骤(3)得到VIGS植株后，对VIGS植株进行柑橘溃疡病抗性评价，判定柑橘CsGSTU18基因沉默能够增强柑橘溃疡病抗性。
[0020]本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
[0021]1、本专利技术实施例提供的一种柑橘CsGSTU18基因，从柑橘感染溃疡病前后差异表达的基因中获得的一个在抗病品种中受柑橘溃疡病菌侵染早期表达下调、在感病品种中侵染早期上调的谷胱甘肽
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S
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转移酶CsGSTU18，在瞬时过表达时可降低柑橘细胞中的H2O2含量，表明CsGSTU18基因是柑橘溃疡病的一个感病基因；
[0022]2、本专利技术实施例提供的一种柑橘CsGSTU18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，通过构建柑橘CsGSTU18基因的VIGS载体，农杆菌介导转化柑橘，得到的柑橘植株能够对溃疡病表现明显抗性，病斑面积降低了36％，病情指数降低了21％，显著减轻溃疡病的发病程度；
[0023]3、本专利技术实施例提供的一种柑橘CsGSTU18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，通过柑橘CsGSTU18基因VIGS沉默能够显著减轻柑橘溃疡病的发病程度，且柑橘CsGSTU18基因VIGS沉默不会影响柑橘植株的表型；
[0024]4、本专利技术实施例提供的一种柑橘CsGSTU18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，通过对VIGS沉默植株的谷胱甘肽
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S
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转移酶活性和H2O2含量检测，表明柑橘CsGSTU18基因沉默可通过增加H2O2含量，进而增强柑橘CsGSTU18沉默植株的溃疡病抗性；
[0025]5、本专利技术实施例提供的一种柑橘CsGSTU18基因及其在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，柑橘CsGSTU18基因还可以作为候选基因同多个溃疡病抗、感病基因利用VIGS沉默、RNA干扰和基因编辑等技术协同进行溃疡病抗性育种，在柑橘抗溃疡病育种中具有重大的应用价值。
附图说明
[0026]为了更清楚地说明本专利技术示例性实施方式的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种柑橘CsGSTU18基因，其特征在于，所述柑橘CsGSTU18基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示或者在SEQ ID NO：1所示核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且具有编码同等活性蛋白的核苷酸序列。2.一种柑橘CsGSTU18基因在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用。3.根据权利要求2所述的柑橘CsGSTU18基因在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，其特征在于，应用方法为降低柑橘属植物中CsGSTU18基因的转录水平。4.根据权利要求3所述的柑橘CsGSTU18基因在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，其特征在于，降低柑橘属植物中CsGSTU18基因转录水平的方式采用VIGS沉默。5.根据权利要求2所述的柑橘CsGSTU18基因在增强柑橘对溃疡病抗性中的应用，其特征在于，应用方法具体包括以下步骤：(1)克隆柑橘CsGSTU18基因的VIGS片段；(2)构建VIGS的表达载体；(3)VIGS表达载体转化柑橘，得到柑橘CsGSTU18基因被沉默的VIGS植株。6.根据权利要求5所述的柑橘CsGSTU18基因在增强柑橘对中的应用，其特征在于，步骤(1)中，柑橘CsGSTU18基因的VIGS片段的克隆方法为：提取柑橘总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板用高保真酶PCR扩增得到柑橘CsGSTU18基因的VIGS片段，核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。7.根据权利要求6所述的柑橘CsGSTU18...

【专利技术属性】
技术研发人员：李强，傅佳，黄馨，喻奇缘，杨雯，樊捷，张晨希，线宝航，何永睿，陈善春，姚利晓，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：