抗红细胞膜抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗红细胞膜抗体及其应用，包括一个重链和一个轻链，所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。所述重链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5所示。所述轻链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8所示。所述抗红细胞膜抗体在构建双功能抗体试剂中的用途。抗红细胞膜抗体用在层析法检测中，处理在样品垫上即可将rbc截留在样品垫，可以检测全血。可以检测全血。

【技术实现步骤摘要】
抗红细胞膜抗体及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，尤其是一种抗红细胞膜抗体及其应用。

技术介绍

[0002]抗红细胞膜抗体(RBC抗体)于1904年由Donatht和Landsteiner首次报道，是人体内第一个被阐明的自身抗体，现称为Donath—Landsteiner(DL)抗体。共分为温抗体(WAS)、冷凝集素抗体(CAs)、DL抗体三大类。该抗体能引起自身免疫性溶血性贫血(AHA)。抗球蛋白试验用于检测抗红细胞膜抗体。抗球蛋白试验有直接和间接两种：直接抗球蛋白试验用于检测红细胞表面的抗体；间接抗球蛋白试验用于检测游离的抗红细胞抗体。SLE和特发性自身免疫性溶血性贫血的抗红细胞抗体是温抗体，绝大多数温抗体为IgG型。冷抗体最常见的是IgM型抗体，SLE伴溶血性贫血与冷抗体有关。抗红细胞膜抗体导致红细胞的破坏，使红细胞数量减少。
[0003]抗红细胞膜抗体同自身免疫性溶血性贫血联系密切，可为自发性、原发性或继发于其他疾病。继发性AIHA大多出现多克隆温抗体自身免疫应答，与HLA
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A1，A8及B8有关；而抗Cas、抗
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DL诱导的AIHA发病机制还不太清楚。通过检测抗
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RBC抗体联合其他溶血性贫血指标(如：LDH升高，网织红细胞增多，触珠蛋白减少等)来诊断AIHA；CAs和抗
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DL抗体造成的红细胞破坏，可引起阵发性寒冷性血红蛋白尿(PCH)；广泛性感染与Was诱导相关，Was在病毒感染，尤其是小儿病毒感染患者中，常可检测到；50％～80％支原体肺炎、30％～50％EBV感染患者血清中可出现Cas。抗
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BrRBC抗体与原发性AIHA和由SLE、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病引发的溶血性贫血皆有关。
[0004]抗红细胞膜抗体经过改造偶联上抗原或其他抗体可以形成双特异性结合物，即近年来发展迅速的双功能抗体。它是—种可与人各种血型红细胞(RBC)结合、不引起血球凝集的非凝集型抗体，但可在抗球蛋白试刑的桥联下，强烈凝集RBC，如血样中含有相应抗体或抗原，则抗RBC抗体与RBC结合,结合物中的抗原或抗体与血样中相应抗体或抗原结合,使得RBC桥联在一起引起凝集。操作方法与查血型一样彻便、快速且特异性强，敏感性高。因此该方法具有广泛的应用前景，现已成功用于HIV及HBV等病毒疾病的诊断。现有技术中采用的抗红细胞膜抗体检测灵敏度低，在层析检测平台的常规使用浓度0.5mg/ml,使用量大。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种抗红细胞膜抗体，所述抗体稳定性好，灵敏度高，可降低使用浓度至0.25mg/ml。
[0006]本专利技术的另一目的是提供所述红细胞膜抗体的应用，比如用在层析法检测中，处理在样品垫上即可将rbc截留在样品垫，可以检测全血。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0008]一种抗红细胞膜抗体，包括一个重链和一个轻链，所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突
变而获得的保守性变异体；
[0009]所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。
[0010]所述重链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5所示。
[0011]所述轻链可变区的CDR1，CDR2，CDR3的序列如SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8所示。
[0012]所述重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；所述轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
[0013]一种多核苷酸片段，其编码上述任意一项所属的抗红细胞膜抗体。
[0014]一种检测试剂，其含有所述的抗红细胞膜抗体。
[0015]一种检测试剂盒，其含有所述的抗红细胞膜抗体。
[0016]所述抗红细胞膜抗体在构建双功能抗体试剂中的用途。
[0017]抗红细胞膜抗体用在层析法检测中，处理在样品垫上即可将rbc截留在样品垫，可以检测全血。
[0018]有益效果：
[0019]本专利技术提供的抗红细胞膜抗体，稳定性好，灵敏度高，可降低使用浓度至0.25mg/ml,使用0.25mg/ml即能将红细胞停留在样品垫上，且背景都比较清晰干净，跑板顺畅。
具体实施方式
[0020]实施例1
[0021]1.抗原免疫过程
[0022]抗原准备过程：取红细胞稀释至2*10^7个/ml，首次免疫取50μl细胞溶液、与100μl弗式完全佐剂；后续免疫取50μl抗原溶液、50μl弗氏不完全佐剂。用两只2ml注射器分别吸取抗原溶液与佐剂，尽可能排掉注射器中的空气并用三通链接，先将抗原推入佐剂中，在反复推动连接好的注射器约20min
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40min，直至乳化后的抗原在水中不扩散为止。
[0023]免疫小鼠过程：选择健康的实验鼠，体表无明显外伤，积极进食，活泼，6至8周龄的老鼠为宜。免疫方法为皮下多点注射抗原进行免疫。第一次免疫后，间隔14天进行第二次免疫。以后间隔7天进行免疫。当第三次免疫之后，每次免疫后第7天断尾取血检测效价，当效价达到要求时即可停止免疫，进行融合。
[0024]2.准备工作
[0025]配制HAT培养基，分装DMEM及PEG。手术器械、50ml塑料离心管、50ml玻璃离心管灭菌。提前一周复苏SP2/0细胞，培养并使之处于良好的生长状态。提前一天用HAT培养基采饲养细胞并铺板，融合一只老鼠需要铺5块饲养细胞版。
[0026]3.融合
[0027]处理SP2/0：吹散，转移至50ml塑料离心管，1000r离心5min，弃上清，加DMEM，
[0028]吹散，1000r离心5min，加DMEM至10ml左右，吹散，计数，备用。
[0029]提取脾细胞
[0030]3.1.小鼠眼窝取血，脱颈处死，血样留作阳性对照。
[0031]3.2分离出小鼠脾脏，先用DMEM冲洗脾脏外部，再DMEM冲洗脾脏内部，收集冲洗液并转移至10ml玻璃离心管，计数。
[0032]3.3 1000r离心5min，弃上清，加DMEM吹散并转移至50ml玻璃离心管，将之前处理的SP2/0同时转移至50ml玻璃离心管，1000r离心5min，弃上清，在手背上磨匀。
[0033]3.4 37℃温水浴，1min内加入1ml PEG，边加边摇，静置90s。
[0034]3.5 1min内加1ml DMEM，30s内加1ml DMEM，逐渐加速，加DMEM至40～50ml，37℃静置10min，800r离心6min，弃上清，加HAT铺板。
[0035]3.6 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗红细胞膜抗体，其特征在于：包括一个重链和一个轻链，所述重链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO ：1 所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；所述轻链的可变区氨基酸序列如SEQ ID NO ：2 所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。2.根据权利要求1所述的抗红细胞膜抗体，其特征在于：所述重链可变区的 CDR1，CDR2，CDR3 的序列如 SEQ ID NO ：3，SEQ ID NO ：4，SEQ ID NO ：5 所示。3.根据权利要求1所述的抗红细胞膜抗体，其特征在于：所述轻链可变区的 CDR1，CDR2，CDR3 的序列如 SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，苏晶，胡慧灵，丁晓倩，
申请(专利权)人：南京珀尔泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：