一种基于荧光PCR实时检测厚唇裸重唇鱼的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光PCR实时检测厚唇裸重唇鱼的引物和探针，所述引物的上游引物为HF6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物为HR6、其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为H

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光PCR实时检测厚唇裸重唇鱼的引物、探针及试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物检测
，具体涉及一种基于荧光PCR实时检测厚唇裸重唇鱼的引物、探针及试剂盒。

技术介绍

[0002]厚唇裸重唇鱼(Gymnodiptychus pachycheilus)属鲤形目(Cypriniformes)、鲤科(Cyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、裸重唇鱼属(Gymnodiptychus)，为我国特有种。其唇发达，肥厚多肉，下唇分左、右叶，表面具明显褶皱，仅肩带及臀鳍基部具少量鳞片，其余部位裸露无鳞，因此得名“厚唇裸重唇鱼”。据相关调查数据显示，厚唇裸重唇鱼主要分布在黄河水系上游和长江流域金沙江水系雅砻江上游。上述分布范围属高原水生生态系统，具有结构简单、生产力低下的特点，且容易受到外界的影响。此外，厚唇裸重唇鱼这类高原鱼类因具有生长缓慢、资源补充周期长、对生境高度适应和依赖等特点，生态系统的扰动将对其野生资源量造成不同程度的影响，甚至破坏。近年来，随着人类活动的增加，包括涉水工程建设、过度捕捞、水环境污染等，以及受到全球气候变化因素的影响，厚唇裸重唇鱼的野生资源量已出现严重衰退，并于2021年被列入国家二级保护动物。因此，建立厚唇裸重唇鱼的快速准确鉴定方法十分必要。
[0003]受到调查人员专业背景和物种本身生物学特性的限制，部分生物类群的生物学信息获取的准确性和信息量有限，例如厚唇裸重唇鱼大多栖息在水体底层，这使得调查人员很难察觉，影响鉴定准确率。再加上长江流域2020年起全面禁捕十年，使得直接监测和评估厚唇裸重唇鱼种群愈发困难。环境DNA技术是一种高灵敏度、低成本、无损伤的物种监测新技术，只需要从水环境样品直接提取DNA，就能够快速检测出目标物种。迄今未见有关厚唇裸重唇鱼的环境DNA的实时荧光鉴定相关的专利文献和非专利文献公开。
[0004]雅砻江上游鱼类中的厚唇裸重唇鱼进行鉴定区分。受限于现有的观察和采样技术，厚唇裸重唇鱼的保护生物学信息相当有限，对它的分布范围和种群情况尚不清楚。且雅砻江鱼类种类较多，地理分布较近的种类分子水平的差异也较小，这对实时荧光特异性Taqman探针的设计造成一定难度。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的在于提供一种基于荧光PCR实时检测厚唇裸重唇鱼的引物和探针。
[0006]本专利技术另一目的在于提供一种厚唇裸重唇鱼的检测试剂盒。
[0007]本专利技术目的通过如下技术方案实现：
[0008]一种基于荧光PCR实时检测厚唇裸重唇鱼的引物和探针，其特征在于：所述引物的上游引物为HF6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物为HR6，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为H
‑
MGB6，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0009]所述探针的5
’
末端和3
’
末端分别连接有荧光基团和淬灭基团。
[0010]本专利技术基于荧光PCR实时检测厚唇裸重唇鱼的引物和探针是根据厚唇裸重唇鱼的线粒体DNA(mtDNA)中12SrRNA的基因序列设计的。
[0011]一种厚唇裸重唇鱼的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下探针和引物：上游引物HF6核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物HR6核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针H
‑
MGB6核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
[0012]采用上述基于荧光PCR引物和探针对厚唇裸重唇鱼的实时检测方法，包括提取厚唇裸重唇鱼DNA、荧光PCR扩增，其特征在于：所述荧光PCR扩增体系优选20μL：包括上述上、下游引物HF6/HR6各0.4μL，上述H
‑
MGB6探针0.4μL，DNA模板2.0μL。
[0013]进一步优选，上述PCR反应条件，两步法扩增反应程序：预变性95℃30sec；然后95℃5sec，60℃30sec循环40次。
[0014]本专利技术具有如下的有益效果：
[0015]现有厚唇裸重唇鱼鉴定完全由人工判定，影响鉴定准确率，本专利技术提供的一种基于环境DNA检测我国特有高原鱼类厚唇裸重唇鱼的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，根据厚唇裸重唇鱼的mtDNA中12SrRNA的基因序列设计特异性引物和探针，建立了厚唇裸重唇鱼的实时荧光PCR检测方法。检测时间大大缩短，可以在6个小时内完成检测，监测结果精确、灵敏度高，本专利技术实时荧光PCR检测的最低DNA浓度可达pg级水平。
[0016]厚唇裸重唇鱼与其地理种群相近的鲤科鱼类在分子水平上的差异也较小，探针选择不好会有假阳性扩增，探针的设计需高度保守，一个碱基不同就有可能不能匹配，这对厚唇裸重唇鱼实时荧光特异性探针的设计造成一定难度，且不同引物的选择对同一探针的扩增效率也有不同；同时，还要确保目的片段的稳定扩增和引物自身不会产生发卡结构和二聚体。并且因本专利技术探针灵敏度高，在qPCR的实验过程中非常容易产生气溶胶污染，导致实验结果出现假阳性，这也大大增加了我们实验难度。最终我们经大量的扩增实验验证发现了厚唇裸重唇鱼特异性引物HF6/HR6和探针H
‑
MGB6相结合具有特异性好、灵敏度高的特点，可以特异性检测厚唇裸重唇鱼DNA，有效区分厚唇裸重唇鱼和其他鲤科鱼类，检测的最低DNA浓度可达2.6
×
10
‑6ng/uL。特异性由引物和探针双重保证，为厚唇裸重唇鱼的鉴定提供了一种新方法，无需采集鱼体样本，可避免对鱼体的损伤，检测准确度高，分析简单快捷，可用于厚唇裸重唇鱼的快速鉴定。
附图说明
[0017]图1：本专利技术引物HF6/HR6和探针H
‑
MGB6在厚唇裸重唇鱼的mtDNA上的位置。
[0018]图2：本专利技术应用引物HF6/HR6和探针H
‑
MGB6对厚唇裸重唇鱼与空白对照进行实时荧光PCR扩增的结果。
[0019]图3：本专利技术应用引物HF6/HR6和探针H
‑
MGB6对厚唇裸重唇鱼和其他物种样品及空白实时荧光PCR扩增的结果。
[0020]图4：本专利技术厚唇裸重唇鱼样品DNA构建的质粒进行10倍梯度稀释后经实时荧光PCR测定的荧光信号曲线图。
[0021]图5：本专利技术厚唇裸重唇鱼样品DNA构建的质粒进行10倍梯度稀释后经实时荧光PCR测定的荧光信号曲线图(Log scale)。
具体实施方式
[0022]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述条件，或按制造厂商所建议的条件。
[0023]实施例1
[0024]厚唇裸重唇鱼环境DNA的实时荧光PCR检测方法，包括如下步骤：
[0025]1.设计引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光PCR实时检测厚唇裸重唇鱼的引物和探针，其特征在于：所述引物的上游引物为HF6，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物为HR6，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述探针为H
‑
MGB6，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。2.如权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的5
’
末端和3
’
末端分别连接有荧光基团和淬灭基团。3. 一种厚唇裸重唇鱼的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括如下探针和引物：上游引物HF6核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；下游引物HR6核苷酸序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕红健，万卓坤，付梅，张连博，丁钰玮，姚维志，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：