一种尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物及其应用。本发明专利技术提供的扩增引物能够通过对样本的DNA进行PCR扩增，鉴定尖膀胱螺。本发明专利技术提供的鉴定方法对设备要求不高，操作简便，适合一般实验室对该物种进行分子生物学鉴定和系统发育研究。学鉴定和系统发育研究。学鉴定和系统发育研究。

【技术实现步骤摘要】
一种尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物及其应用


[0001]本专利技术属于入侵生物鉴定与分类
具体涉及一种尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物及其应用。

技术介绍

[0002]生物入侵指生物由原生存地经自然的或人为的途径侵入到另一个新的环境，对入侵地的生物多样性、农林牧渔业生产以及人类健康造成经济损失或生态灾难的过程。外来入侵种是指对人类健康、物种、栖息地、生态系统带来威胁的外来种。
[0003]根据中华人名共和国生态环境部2021年5月发布的《2020中国生态环境状况公报》显示，目前我国已发现660多种外来入侵物种。其中，71种对自然生态系统已造成或具有潜在威胁并被列入《中国外来入侵物种名单》。外来入侵种是指由于其引入己经或拟将使经济或环境受到损害，或危及人类健康的外来物种。
[0004]尖膀胱螺(Physa acuta)隶属于软体动物门、腹足纲、肺螺亚纲，基眼目，膀胱螺科，膀胱螺属。在除南极洲外的所有大陆淡水流域中均有发现。二十世纪六十年代开始入侵我国，过去三十多年中，尖膀胱螺陆续在我国台湾、香港、广东、云南、江苏、北京等地区发现其分布。
[0005]成年尖膀胱螺个体为贝壳中等大小，壳高6～14mm，壳宽3～8mm。贝壳呈长卵圆形，表面光滑，壳质略薄，左旋，无厣。螺旋部顶端尖锐，各螺层逐渐膨胀，体螺层极度膨大。壳表面多呈黄褐色或者黑褐色。该螺生长纹细致但不明显，部分个体有凹纹。尖膀胱螺头部具有一对眼，分别位于尖而细长的触角基部内侧。
[0006]尖膀胱螺常见于流速缓慢的河口地带及阴湿通气的沟渠、沼泽等。经常集群生活于水域边缘较浅处，或依附于水生植物水中的叶子、枝干上，也能短暂在陆地上生活，主要以附生藻类和有机碎屑为食。尖膀胱螺有蛰伏和冬眠习性，在温度过低时会钻入泥土中，进入休眠状态度过环境恶劣时期。尖膀胱螺为雌雄同体，能自体受精，该螺产卵量极大，生长条件优越时可连续产卵，胚胎发育过程与温度有密切关系。
[0007]尖膀胱螺系多种重要寄生虫如广州管圆线虫和卷棘口吸虫的中间宿主。如果人误食或接触带疫尖膀胱螺都有可能感染此病。
[0008]在国内外关于尖膀胱螺分子系统发育方面的研究，虽然已有基于COⅠ基因序列的相关研究，但扩增引物均为底栖动物通用引物，扩增片段较短(约650bp左右)，得到的相关遗传信息较少，易与假线粒体基因混淆。迄今为止尚未见到有关尖膀胱螺特异性引物设计和测序结果的相关报道。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种尖膀胱螺的扩增引物及应用。本专利技术旨在提供一种尖膀胱螺线粒体COⅠ基因扩增引物，并通过扩增和测序验证其特异性。该方法操作简单，适合外来物种鉴定使用。所开发的尖膀胱螺特异性扩增引物对该物种的COⅠ基因全长扩增效率高，
获得的遗传信息全，可用对该物种进行分子生物学鉴定和系统发育研究。
[0010]为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了如下方案：
[0011]本专利技术第一方面提供了尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物，所述扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。
[0012]进一步的，所述扩增引物的目的片段的DNA序列如SEQ ID NO:3所示。
[0013]本专利技术第二方面提供了所述尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物在鉴定尖膀胱螺中的应用，所述应用的方法包括：采用上述序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的扩增引物对样本的DNA进行PCR扩增，PCR扩增的产物进行测序。
[0014]进一步的，鉴定尖膀胱螺的方法具体包括以下步骤：
[0015](1)取乙醇浸泡的待鉴定样本的腹足部肌肉组织，采用CTAB法提取样本总DNA，检测纯度后作为样本DNA，置于超低温冰箱保存；
[0016](2)设定PCR扩增程序，采用上述序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的扩增引物对需要鉴定的样本的DNA序列进行PCR扩增，用凝胶电泳检测扩增效果，筛选主带大小符合目的片段长度的序列，进行DNA片段的进行回收，获得PCR扩增的产物，并对该产物进行测序。
[0017]进一步的，所述PCR扩增的方法为：第一步：94℃预变性5min；第二步：94℃变性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min，循环35次；第三步72℃延伸10min。
[0018]进一步的，所述步骤(1)中检测纯度OD
260/280
比值达到1.6～1.8后稀释至20～25ng/μl。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的优点和有益效果是：本专利技术提供的鉴定方法对设备要求不高，操作简便，适合一般实验室对该物种进行分子生物学鉴定和系统发育研究。获得的COⅠ基因全长序列，包含COⅠ基因所有遗传信息，可用于该类群样本遗传分析。
附图说明
[0020]图1是利用本专利技术的特异性扩增引物扩增尖膀胱螺样本COⅠ基因的琼脂糖电泳照片。
[0021]图2是利用本专利技术的特异性扩增引物扩增尖膀胱螺样本COⅠ基因建立的NJ系统进化树。
具体实施方式
[0022]为了使本
的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。
[0023]实施例1：尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物的设计
[0024]申请人设计了尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物如下：通过在美国国家生物技术信息中心核酸数据库中搜索下载尖膀胱螺线粒体基因组的全序列(SEQ ID NO:3)如下：
[0025]TTGCGTTGATTATATTCTACTAATCATAAAGATATTGGAACATTATATTTAATTTTTGGGATCTGGTGTGGATTGGTCGGTACAGGTTTAAGCTTGTTAATTCGTTTGGAATTAGGAACATCTCTTGTACTGTTTGATGAACATTTTTATAATGTAATTGTTACAGCACATGCTTTTGTAATGATTTTTTTTATAGTTATACCAATAATAATTGGAGGGTTTGGGAATTGAATAGTGCCTATATTAATTGGTGCTCCTGATATAAGATTTCCTCGAATAAATAATATAAGATTTTGACATTTACCACCTTCCTTTATCTTATTATTATGTAGGTCTATAGTTGAGGGTGGAGTTGGAACTGGATGAACTGTTTATCCTCCTCTATCAGGACCTGTAGCTCACTCTGGTTCCTCAGTAGATCTTGCTATTTTCTCATTA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种尖膀胱螺(Physa acuta)线粒体COⅠ基因的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的正向引物、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的反向引物。2.根据权利要求1所述的尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物的目的片段的DNA序列如SEQ ID NO:3所示。3.权利要求1或2所述的尖膀胱螺线粒体COⅠ基因的扩增引物在鉴定尖膀胱螺中的应用，其特征在于，所述应用的方法包括：采用上述序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的扩增引物对样本DNA进行PCR扩增，PCR扩增的产物进行测序。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，鉴定尖膀胱螺的方法具体包括以下步骤：(1)取乙醇浸泡的待鉴定样本的腹足部肌肉组织，采用CTAB法...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁本起，宋文涛，杨敬杰，黄婷婷，邓传光，郝鹏举，
申请(专利权)人：青岛斯坦德衡立环境技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：