一种用于薄壳山核桃EST-SSR标记的引物组及其试剂盒与应用制造技术

本发明专利技术提供了一种用于薄壳山核桃EST

【技术实现步骤摘要】
一种用于薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的引物组及其试剂盒与应用


[0001]本专利技术属于分子标记
，尤其涉及一种用于薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的引物组及其试剂盒与应用。

技术介绍

[0002]薄壳山核桃又名美国山核桃、长寿果、碧根果，是世界上著名的干果树种之一。果实种仁中含有高达70％左右的油脂，含量高于油茶籽、核桃、橄榄、山桐籽，是含油量最高的木本油料作物之一。目前，良种稀缺仍是制约薄壳山核桃种植效益提升的一个重要因素。为培育高产、优质、多抗的新种质，需要明确薄壳山核桃种质资源间的遗传多样性和亲缘关系。在长期引种栽培过程中，同一个品种可能有不同的命名，导致同名异物和同物异名现象非常严重，各品种之间亲缘关系不清。这给育种过程中，亲本的选配造成了很大的影响。因此，建立快速可靠的薄壳山核桃种质资源亲缘关系鉴定技术体系，具有重要的现实意义。
[0003]分子标记是研究植物遗传多样性的有利工具，具有准确性高、重复性好、不受环境条件干扰等优点。简单重复序列(Simple sequence repeats，SSR)，又称微卫星，是一种共显性的分子标记，具有操作简单、准确性高、稳定性好等特点，被广泛应用在植物遗传多样性和亲缘关系的分析方面。当遗传相似性为1(遗传距离为0)时，表明植株出自同一无性系。根据SSR的来源，可将其分为表达序列标签微卫星(Expressed sequence tag
‑
simple sequence repeat,EST
‑<br/>SSR)和基因组微卫星(Genome simple sequence repeat,gSSR)。相比于gSSR，EST
‑
SSR具有更高的种间通用性，因此对于种间杂交更具有指导意义。因此，开发可用于薄壳山核桃种质资源多样性分析和亲缘关系鉴定的EST
‑
SSR标记很有必要。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的引物组及其试剂盒与应用。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供了以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种用于薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的引物组，所述引物组包括16对引物，其各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～SEQ ID No.32所示。
[0007]本专利技术还提供了一种用于薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的试剂盒，所述试剂盒包括上述的引物组。
[0008]优选的，所述试剂盒还包括PCR扩增体系。
[0009]优选的，所述PCR扩增体系为12.5μL的2
×
TsingkeMasterMix，1μL10μM的上游引物，1μL10μM的下游引物，1μL10ng/μL的DNA，9.5μL的ddH2O。
[0010]本专利技术还提供了一种上述引物组或试剂盒在薄壳山核桃种质资源遗传多样性和亲缘关系分析中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种上述引物组或试剂盒在鉴定薄壳山核桃品种中的应用。
[0012]优选的，上述应用包括以下步骤：
[0013]S1取待鉴定薄壳山核桃样品，提取基因组DNA；
[0014]S2以S1步骤中得到的基因组DNA为模板，利用SEQ ID No.1～SEQ ID No.32所示的引物组进行PCR扩增；
[0015]S3根据PCR扩增产物进行薄壳山核桃遗传多样性、亲缘关系和品种分析鉴定。
[0016]优选的，所述薄壳山核桃样品为薄壳山核桃叶片或枝条。
[0017]优选的，所述PCR扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性35s，55～58℃退火复性35s，72℃延伸35s，共32个循环；最终72℃延伸3min。
[0018]相对于现有技术，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]本专利技术提供了一种用于薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的引物组及其试剂盒与应用，本专利技术的引物组可以明确种质间的遗传多样性，同时可以将有系谱关系的种质聚在一个分支，可用于薄壳山核桃种质资源遗传多样性和亲缘关系的分析。相比于形态学鉴定，本专利技术采用引物组得到的鉴定结果不受环境影响，具有高效、准确和稳定的优点，该鉴定结果能够为薄壳山核桃种质创新提供基本数据，以更有效地选择合适的育种亲本。
附图说明
[0020]图1为16对引物扩增40份薄壳山核桃种质PCR产物的聚丙烯酰胺图谱；其中M，marker；1～40，对应表2中所述的薄壳山核桃种质资源；
[0021]图2为40份薄壳山核桃种质SSR标记的UPGMA聚类分析图。
具体实施方式
[0022]本专利技术提供了一种用于薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的引物组，所述引物组包括16对引物，其各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～SEQ ID No.32所示，具体的引物组信息见表1。
[0023]表1 16对EST
‑
SSR标记的引物信息
[0024][0025][0026]在本专利技术中，所述引物组的获取方法，优选的包括如下步骤：
[0027](1)从薄壳山核桃基因组数据库中提取UTR和CDS序列；
[0028](2)利用MISA脚本对SSR位点进行检索；
[0029](3)使用Primer3软件对检索到的SSR位点进行引物设计，得到设计的EST
‑
SSR引物；
[0030](4)以提取的薄壳山核桃的基因组DNA为模板，用设计的EST
‑
SSR引物进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳结果数据筛选得到薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的引物组。
[0031]在本专利技术中，对薄壳山核桃基因组数据库中提取UTR和CDS序列。本专利技术从数据库中筛选薄壳山核桃基因组序列和基因注释文件，然后提取UTR和CDS序列，相比于传统的用转录组数据开发SSR，不需要原始数据的组装，筛选方法更简便快捷。
[0032]在本专利技术中，利用MISA脚本对SSR位点进行检索。所述检索的参数设置优选为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的最少重复次数分别为10、6、5、5、5、5个；复合型SSR的检索条件优选是2个SSR片段间的距离≤100bp。
[0033]在本专利技术中，使用Primer3软件对检索到的SSR位点进行引物设计，得到设计的EST
‑
SSR引物。所述引物设计的参数优选为：引物大小18～27bp，PCR产物长度100～280bp，GC含量40％～60％，退火温度57～63℃。
[0034]在本专利技术中，以提取的薄壳山核桃的基因组DNA为模板，用设计的EST
‑
SSR引物进行PCR扩增，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据电泳结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的引物组，其特征在于，所述引物组包括16对引物，其各引物的核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1～SEQ ID No.32所示。2.一种用于薄壳山核桃EST
‑
SSR标记的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR扩增体系。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增体系为12.5μL的2
×
Tsingke MasterMix，1μL 10μM的上游引物，1μL 10μM的下游引物，1μL 10ng/μL的DNA，9.5μL的ddH2O。5.权利要求1所述引物组或权利要求2～4任意一项所述试剂盒在薄...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫正海，娄文睿，宣继萍，胡龙娇，廖盼华，翟敏，贾展慧，
申请(专利权)人：江苏省中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：