检测牡丹黄斑病菌的LAMP引物组、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及检测牡丹黄斑病菌的LAMP引物组、试剂盒及其应用，属于分子生物学领域，本发明专利技术基于牡丹黄斑病菌核糖体DNA上的保守区域——内转录间隔区ITS设计DNA体外扩增引物，通过体外扩增后的颜色反应及电泳条带，建立了一种简便快速检测斑点叶点霉的方法，解决了现在牡丹黄斑病早期诊断时依据病菌形态学特征、结合分子序列鉴定所存在的一些技术问题，本发明专利技术建立的牡丹黄斑病菌的LAMP检测技术，与现有技术相比具有快速高效、费用较低、灵敏度高、特异性强以及产物检测方便等特点，为生产中牡丹黄斑病的早期诊断和及时防控提供理论依据。黄斑病的早期诊断和及时防控提供理论依据。黄斑病的早期诊断和及时防控提供理论依据。

【技术实现步骤摘要】
检测牡丹黄斑病菌的LAMP引物组、试剂盒及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及检测牡丹黄斑病菌的LAMP引物组、试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]（一）牡丹黄斑病现有诊断技术2.1 黄斑病已成为牡丹产业发展的制约因素之一牡丹不仅因其花大而香、花色艳丽而具有极高的观赏价值，而且根部含有抗菌消炎物质——丹皮酚，籽粒中含有42%以上的α
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亚麻酸、92%以上的不饱和脂肪酸等数十种营养成分，使牡丹同时具有很高的药用和食用价值。发展好牡丹籽油产业，对于破解我国食用油对外依存度过高的困局、保障我国食用油安全和人民群众身体健康等都具有重要意义。牡丹耐旱耐贫瘠，适合荒山绿化造林、林下种植，在我国与文冠果等木本油料作物套种，经济收益明显，会发挥越来越重要的作用。
[0003]随着连作时间的延长，有害生物对牡丹种植带来越来越严重的威胁。其中，尤以牡丹叶部病害对牡丹生产的威胁最为严重。由斑点叶点霉（Phyllosticta commonsii）引起的黄斑病是发生最为普遍的牡丹叶部病害之一：初期病斑为圆形或近圆形，黄褐色或黄白色，稍凹陷，病斑大小3～5mm；后期病斑逐渐连接成片，病斑黄色至褐色，不形成穿孔，空气潮湿时病斑上散生小黑点，为病菌的分生孢子器。斑点叶点霉主要以菌丝体或分生孢子器在发病组织及其残枝落叶上越冬，在来年春天产生分生孢子，可以通过风和雨传播，牡丹的下部叶片先发病，阴雨潮湿的环境会加重黄斑病的发生和病原菌的再侵染。黄斑病发病初期的症状和叶霉病、黑斑病、灰霉病等多种其它叶部病害很难区分，往往在病害中后期才容易分辨。这造成了生产中牡丹种植园即使采取相应的防治措施，但防治时期滞后，而发病后期对病害的防治效果已不明显。由于病菌对药剂的敏感性不同，如果在发病晚期对黄斑病喷药防治，不仅会增加生产成本，造成药液浪费并污染环境，而且还起不到防治病害的效果。因此，为了及时控制牡丹黄斑病害的发生，在发病初期进行牡丹黄斑病菌的早期诊断就显得至关重要。
[0004]2.2 黄斑病早期诊断的传统技术由于发病早期，斑点叶点霉在牡丹叶片表面尚不能形成典型病征，且此时病状和其它叶部病害很难区分，故此时对黄斑病诊断不能采用病征刮、挑或徒手切片的方法，而只能采用病菌分离、纯培养后制片镜检，必要时结合基因序列分析的方法。
[0005]斑点叶点霉传统的组织分离法操作步骤如下：1 物品准备：实验室内准备马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA），准备灭菌的培养皿、无菌水等物品，所需器材包括：必备物品有灭菌锅、超净工作台、培养箱、显微镜、挑针等；选备物品有PCR仪、凝胶电泳系统，移液器，PCR管、离心管，TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、液氮等（如果病菌不产孢，就需进行分子鉴定）；2 病菌分离：挑取单个发病病斑，从病健交界处切下大小4～5 mm的组织块，用75%
酒精消毒20s左右，再用3%的NaClO溶液消毒3min，最后用无菌水漂洗3次，滤纸吸干水后转入含有乳酸的PSA培养基上，每皿4～5块，26℃倒置培养5天，待病组织小块上长出同心轮纹无杂菌的真菌菌落时，用接种针挑取菌落边缘小块至斜面培养基上，培养3～4天，得到纯菌种，便可置于冰箱中保存。对菌落形态观察，看是否与斑点叶点霉菌落形态相符；3 形态学鉴定：从菌落中挑取少许培养物，置于显微镜下，低倍镜下观察，后转到高倍镜，看是否有斑点叶点霉的孢子、分生孢子器等典型结构；4 如果显微镜下观察不到孢子，则需通过CTAB法提取病菌的基因组DNA，依据通用引物，对病菌的rDNA
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ITS序列进行扩增，扩增后送到生物公司测序；得到序列后在基因组数据库上比对，看是否为斑点叶点霉。
[0006]黄斑病早期诊断的流程图如图1所示。
[0007]后期，为了简化病菌的分离，课题组依据斑点叶点霉和其它常见污染菌对药剂的敏感性不同，通过向基础培养基（PSA）中添加多菌灵、乙膦铝及代森锰锌等抑菌物质，筛选到了一种专一分离斑点叶点霉的选择性培养基。尽管简化了病菌分离的操作步骤，但后面的病菌鉴定仍无法改变。（参考文献：徐建强, 秦玉佳, 张馨, 刘哲然, 李鹏飞, 夏彦飞, 郑伟, 侯颖. 一种快速分离牡丹黄斑病病原菌的选择性培养基. 农药学学报, 2020, 22(3): 550
‑
555.）。
[0008]（二）本专利技术技术背景环介导等温扩增（Loop
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mediated isothermal amplification，LAMP）技术由日本科学家Notomi等专利技术并首次报道，它能够在等温（60
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65 ℃）条件下利用链置换Bst DNA聚合酶和特异性引物短时间（通常<1 h）内大量扩增核酸片段。该技术具有快速高效、费用较低、灵敏度高、特异性强以及产物检测方便等特点，因此受到各国研究学者们的广泛关注，目前已被广泛应用于临床诊断、食品安全、动物疫病检测、植物病原物检测及环境监测等领域，具有广泛的发展应用前景。在植物病原菌检测方面，可用于检测植物病原真菌、细菌、病毒和线虫等。LAMP产物的检测可通过在反应体系中添加DNA嵌合染料SYBR green I或金属离子指示剂羟基萘酚蓝（HNB）和钙黄绿素后产生的颜色变化通过肉眼观察来判断；也可以将产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，看是否形成典型的梯形条带来进行。但DNA嵌合染料SYBR green I是在反应完成后添加的，会增加产物污染的机会，造成假阳性。为了避免此类污染，可在扩增前向反应体系中添加HNB染色剂，LAMP反应扩增完成后，产应液的阳性产物为天蓝色，而阴性产物仍保持紫色。颜色的变化通过2.0%琼脂糖凝胶电泳再次验证（即用2.0%的琼脂糖凝胶电泳时，阳性扩增形成产生典型的梯形条带，但阴性产物则不形成）。
[0009]（三）植物病害早期诊断在植物病害综合防控中的重要性“预防为主、综合防治”是我国植物保护工作的基本方针。对植物病害的防治，早发现、早治疗比事后喷药防治要有效得多。这要求生产中能有一种对植物某一病害早期诊断的方法。但现在的植物病害诊断，往往都是依据病菌在发病部位形成的病征，镜检后再进行分子序列比对后做出判断，所需时间较长，而对于病原生物引起的流行性病害，从早期病斑到大范围流行，所需时间很短，所以现在的植物病害诊断方法，无法满足早期诊断的要求。
[0010]病害发生早期，病斑相似，单纯从病状上很难区分；牡丹黄斑病发病早期，在叶片上形成圆形斑点，而叶霉病、炭疽病、灰霉病、黑斑病等都是如此，所以早期很难判断。由于不同病菌对药剂的敏感性不同，对病害的早期诊断还有利于指导生产中的用药选择。只有
实现了对病害早期的快速、正确诊断，才能依据病菌种类的不同来选择合适的药剂，从而做到早发现、早确诊、早防治。
[0011]对牡丹黄斑病诊断现有技术存在的缺陷以及原因进行分析：（一）牡丹黄斑病诊断现有技术牡丹黄斑病的现有诊断技术，需对田间疑似病叶进行症状观察、组织分离、纯化培养之后再通过查阅相关资料进行形态学鉴定，需要观察病菌的产孢结本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测牡丹黄斑病菌的LAMP引物组，其特征在于：所述LAMP引物组包含外引物2
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F3和2
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B3以及内引物2
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FIP和2
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BIP；所述外引物和内引物的核苷酸序列分别为：2
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F3：GCCTGTTCGAGCGTCATT；2
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B3：AGTTCAGCGGGTATCCCT；2
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FIP：CGCCGGCTGCCAATTGTTTTGTGGTGTTGGGTGTTTGTCTC；2
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BIP：GCGCAGTACATCTCGCGCTTCCTGATCCGAGGTCAAGAGT。2.一种检测牡丹黄斑病菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1所述的LAMP引物组。3.权利要求1所述的LAMP引物组或权利要求2所述的试剂盒在牡丹黄斑病早期诊断中的应用。4.一种检测牡丹黄斑病菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、提取待测样品总DNA；步骤二、以步骤一所得DNA为模板，采用权利要求1所述的LAMP引物组进行扩增反应；步骤三、根据步骤二的扩增反应结果判定是否含有牡丹黄斑病菌。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：步骤一中，采用简易法提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯颖，郑伟，殷消茹，郑毅恒，李毅昊，李建锋，
申请(专利权)人：河南科技大学，
类型：发明
国别省市：