一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法和应用，属于生物技术领域。所述制备方法包括：将IKKα重组蛋白与弗氏佐剂等量混合乳化后，免疫动物得到多克隆抗体；其中，所述IKKα重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明专利技术通过构建猪源IKKα基因的原核和真核表达载体，制备特异性的多克隆抗体，验证了该多克隆抗体可以特异性结合IKKα因子的蛋白，并且CSFV感染PK

【技术实现步骤摘要】
一种猪IKK
α
多克隆抗体的制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法和应用。

技术介绍

[0002]猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种急性、败血性和接触性传染病，在全球各地广泛流行，对养猪业造成了巨大经济损失。CSFV属于黄病毒科、瘟病毒属成员，基因组大小约12.5kb，是一种二十面体包膜单股正链RNA病毒，具有正负极性和脂质膜，只有一个开放阅读框(Open reading frame,ORF)，编码3898aa的前体多聚蛋白，分子量438kDa，在这些前体多聚蛋白经翻译后加工变成四种结构蛋白(C、E
rns
、E1和E2)和八种非结构蛋(N
pro
、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)。CSFV侵入宿主后，与宿主细胞蛋白发生一系列的相互作用，参与致病机制和免疫应答过程。
[0003]核因子
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κB(nuclear factor
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kappa B,NF
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κB)是在成熟的B淋巴细胞发现的一种重要的转录因子，可启动众多基因的转录，目前已经发现组织细胞和多种病毒增强子和启动子都存在NF
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κB的作用基序，有文献表明NF
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κB的激活是大多数病毒感染的一个标志，如猪繁殖与呼吸综合征病毒和丙型肝炎病毒通过激活和抑制NF
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κB从而影响细胞的生长，使其有利于自身的复制和传播。然而对于猪瘟病毒是否能激活NF
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κB信号通路目前依然存在争议，一方面猪瘟病毒的N蛋白证明与IKBα互作，但在PK
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15细胞或外周血单核细胞中未观察到NF
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κB的激活和二者的共定位。另一方面慢病毒载体表达猪瘟非结构蛋白Npro，NS2，NS3，NS4B和NS5A均不能诱导NF
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κB的激活，但在猪肺泡巨噬细胞中观察到了病毒感染后NF
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κB的核移位。因此CSFV与NF
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κB的作用机制依然有待于被揭示。
[0004]IkB激酶(IkB kinase,IKK)是NF
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κB信号转导途径的上游成分。在外界信号刺激下，经过进一步的信号转导从而激活IKK复合体，活化NF
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κB，后者进入细胞核内，调节许多基因的表达，在炎症反应、免疫反应、细胞增殖和细胞凋亡等诸多生物过程中发挥着重要的作用。主要由IKKα，IKKβ和NEMO组成，其中IKKα基因全长2235bp，编码744aa，蛋白分子量约为84kDa。IKKα蛋白结构域主要由三个部分组成，包括氨基端的激酶结构域、中间的LZ结构域和HLH结构域。IKK复合物家族中IKKα与IKKβ的氨基酸序列同源性在50％以上，整体上相似度高达70％，其中含亮氨酸拉链结构和HLH结构域的C端有44％的同源性；而N端激酶区同源性高达64％。突变分析表明，IKKα和IKKβ二聚化的形成主要由LZ结构域介导，在NF
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κB信号通路的激活中扮演着至关重要的角色。IKKα是IкB激酶的催化亚基，具有调节自噬及细胞凋亡的功能。细胞核中的IKKα可影响细胞存活，IKKα通过稳定和活化转录因子P73，从而促进细胞凋亡。此外，IKKα通过调控自噬蛋白UVRAG的表达，间接影响细胞内的自噬蛋白水平，继而导致自噬依赖的caspase
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8激活。相关研究表明，在机体肿瘤形成和抑制的调控机制中，IKK复合物同样具有重要的作用，发挥着促进肿瘤转移的生理功能，在前列腺癌的病理过程中，肿瘤器官首先发生浸润，产生炎性细胞，核中IKKα导致肿瘤抑制因子maspin招募
DNA甲基转移酶，引起抑制因子的转录抑制。此外，NF
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κB信号通路上的IKKα生理功能不仅有促肿瘤作用，同时也具有抗肿瘤的功能。
[0005]另外，IKKα还是首次发现的信号转导途径中直接进入细胞核内调节基因表达的上游成分，有研究表明IKKα在细胞质和细胞核中都有分布，并且已有证据表明IKKα能在细胞质和细胞核之间穿梭，鼠成纤维细胞在受到TNF
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α刺激时，IKKα在细胞核内显著积累，而IKKβ和NEMO则没有明显的变化，这说明IKKα可以直接进入细胞核内，并有可能参与调节基因的表达。众所周知，染色质的基本单位是核小体，核小体是由DNA缠绕组蛋白构成。碱性组蛋白存在诸如乙酰化、磷酸化、甲基化和ADP
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核糖基化等多种化学修饰，这些修饰作用可引起染色质的结构发生改变而影响基因的表达，其中组蛋白H3的乙酰化和磷酸化对于NF
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κB应答基因的活化至关重要。研究发现，CBP具有组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)活性，能催化组蛋白H3的Lys14发生乙酰基化,进而激活NF
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κB应答基因，而CBP的HAT活性是由组蛋白H3的Ser10发生了磷酸化而引起的。后续的研究结果恰恰证实了IKKa正是催化组蛋白H3上Ser10磷酸化的激酶。在用TNF
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a处理MEF时,发现细胞中组蛋白H3的Ser10磷酸化以及Lys14乙酰化水平都增加，进一步发现，在IKKa
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/
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细胞中，无论是否用TNF
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a处理，组蛋白H3的Ser10磷酸化以及Lys14的乙酰化水平都显著降低，这说明组蛋白H3的Ser10磷酸化必需有IKKa的参与。体外试验的结果表明，组蛋白H3是IKKa直接作用的底物。由上述可见，在外界信号如TNF
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a刺激下，IKK复合体中的IKKa直接进入了细胞核内，IKKa通过其自身的激酶活性催化组蛋白H3上Ser10磷酸化，进而激活了CBP的组蛋白乙酰转移酶活性，导致组蛋白H3上Lys14发生乙酰基化，从而激活特定NF
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κB应答基因的表达。
[0006]目前，针对人和鼠的IKKα基因已经进行了较为深入研究，而关于猪IKKα的研究相对较少，并无猪IKKα商品化抗体，且在CSFV感染过程中的作用鲜有报道，难以对猪源IKKα蛋白生物学特性，细胞定位及其与CSFV的相互作用等机制进行深入探索，同时也对CSFV与NF
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κB的研究工作造成了阻碍。在研究病毒蛋白的功能以及病毒与宿主的相互作用机理中，抗体是重要且有效的工具，因此，制备一种针对猪源IKKα的特异性抗体对于探索其与CSFV之间的关系具有重要作用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是提供一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过构建猪源IKKα基因的原核和真核表达载体，并制备具有良好特异性的多克隆抗体，验证了该多克隆抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将IKKα重组蛋白与弗氏佐剂等量混合乳化后，免疫动物得到多克隆抗体；其中，所述IKKα重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.如权利要求1所述的一种猪IKKα多克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述IKKα重组蛋白的构建方法包括如下步骤：将IKKα原核表达载体转化BL21(DE3)感受态细胞制备重组基因工程菌，再利用IPTG诱导所述重组基因工程菌表达目的蛋白，...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗廷荣，李晓宁，金奕欣，赵祥秀，黄茂发，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：