一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法技术

本发明专利技术属于微生物遗传转化技术领域，具体涉及一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。本发明专利技术以磷酸缓冲液溶解崩溃酶和溶壁酶制备成酶解液对炭疽菌菌丝进行裂解制备炭疽菌原生质体，获得的原生质体数量多，质量好，且步骤简便易操作。以此方法获得的炭疽菌原生质体可以快速有效构建得到PEG介导的炭疽菌遗传转化体系，且转化效率较高。且转化效率较高。且转化效率较高。

【技术实现步骤摘要】
一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法


[0001]本专利技术属于微生物遗传转化
，具体涉及一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法。

技术介绍

[0002]山茶炭疽菌为炭疽菌属(Colletotrichum)真菌，是茶树炭疽病的主要优势病原种之一，对茶树具有较高的致病性和危害。为了降低山茶炭疽菌对茶树的危害，防控茶树炭疽病，采用基因工程手段对山茶炭疽菌致病相关基因进行研究尤为重要，然而，目前对于山茶炭疽菌致病相关基因的功能分析鲜见报道，原因在于缺少稳定的山茶炭疽菌遗传转化体系，无法满足山茶炭疽菌致病相关基因功能分析的基本要求，进而迫切需要建立高效稳定的PEG介导的山茶炭疽菌遗传转化体系，为后续研究山茶炭疽菌的关键致病基因提供技术依据。
[0003]尽管，现有技术中也存在山茶炭疽菌遗传转化体系的相关研究，但是其多采用裂解酶对山茶炭疽菌的原生质体进行提取所获得的原生质体数量少，质量差，且步骤繁琐，导致山茶炭疽菌的遗传转化效率不高。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种炭疽菌原生质体的制备方法及遗传转化体系的构建方法，所述炭疽菌原生质体的制备方法制备得到的原生质体数量多，质量好且步骤简便，进而可以提高后续遗传转化体系的转化效率。
[0005]本专利技术提供了一种炭疽菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：
[0006]将炭疽菌菌丝与酶解液混合，裂解，得到裂解液；
[0007]将所述裂解液培养3～8h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括炭疽菌原生质体；
[0008]所述酶解液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括磷酸缓冲液，所述溶质包括崩溃酶1～3wt.％和溶壁酶0.5～1wt.％。
[0009]优选的，所述炭疽菌原生质体在所述原生质体液中的浓度为(1.6～3.6)
×
107个/mL。
[0010]优选的，所述裂解的震荡频率为80～120rpm，温度为28～32℃，时间为10～30min。
[0011]优选的，所述炭疽菌包括山茶炭疽菌。
[0012]优选的，所述炭疽菌菌丝的制备方法包括：
[0013]将活化的炭疽菌菌株接种至孢子培养基中进行孢子培养，得到分生孢子；
[0014]将所述分生孢子接种至菌丝培养基中进行菌丝培养，得到炭疽菌菌丝；所述菌丝培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～16h。
[0015]本专利技术还提供了上述技术方案所述的制备方法在构建炭疽菌遗传转化体系中的应用。
[0016]本专利技术还提供了一种炭疽菌遗传转化体系的构建方法，包括如下步骤：
[0017]采用上述技术方案所述的制备方法制备得到炭疽菌原生质体；
[0018]将所述炭疽菌原生质体与STC溶液混合，得到炭疽菌原生质体悬浮液；
[0019]将所述炭疽菌原生质体悬浮液、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒、肝素钠溶液混合，0～4℃静置30min，得到第一原生质体溶液；
[0020]向所述第一原生质体溶液中逐滴加入SPTC溶液，0～4℃静置30min，得到第二原生质体溶液；
[0021]将所述第二原生质体溶液悬浮于再生培养基复苏，得到复苏的原生质体溶液；
[0022]将所述复苏的原生质体溶液与选择性培养基混合，暗培养3～5d，得到炭疽菌遗传转化体系。
[0023]优选的，所述炭疽菌原生质体悬浮液的体积、含有抗生素标记基因和目的基因的质粒的质量和肝素钠溶液的体积的比值为0～100μL：1～5μg：1～2μL；所述炭疽菌原生质体悬浮液中山茶炭疽菌原生质体的浓度为(1～3)
×
105个/μL；所述肝素钠溶液的浓度为0.1g/mL。
[0024]优选的，所述再生培养基以水为溶剂，包括：酵母粉1wt.％，酪蛋氨基酸1wt.％和蔗糖274wt.％；pH值为7.0；
[0025]所述选择性培养基以水为溶剂，包括：马铃薯汁20wt.％，葡萄糖2wt.％，琼脂1.5wt.％和与所述抗生素标记基因对应的抗生素。
[0026]优选的，所述抗生素标记基因包括G418抗性表达基因。
[0027]有益效果：
[0028]本专利技术提供了一种炭疽菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：将炭疽菌菌丝与酶解液混合，震荡裂解，得到裂解液；将所述裂解液进行震荡培养3～8h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括炭疽菌原生质体；所述酶解液以磷酸缓冲液为溶剂，包括崩溃酶1～3wt.％和溶壁酶0.5～1wt.％。本专利技术以磷酸缓冲液溶解崩溃酶和溶壁酶制备成的酶解液对炭疽菌菌丝进行裂解制备炭疽菌原生质体，获得的原生质体数量多，质量好，且步骤简便易操作。以此方法获得的炭疽菌原生质体可以快速有效获得PEG介导的炭疽菌遗传转化体系，且转化效率较高。
附图说明
[0029]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0030]图1为实施例1～6和对比例1中制备得到的裂解液中的炭疽菌原生质体数量统计图；
[0031]图2为实施例1～6和对比例1中制备得到的裂解液中的炭疽菌原生质体形态图；
[0032]图3为实施例7中的G418抗性筛选结果；
[0033]图4为测试例2中转化子基因组提取的琼脂糖凝胶电泳检测图；
[0034]图5为测试例2中转化子中目的基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳检测图；
[0035]图6为测试例2中荧光显微镜下观察转化子中的GFP荧光图；
[0036]图7为实施例8中山茶炭疽菌遗传转化体系的构建方法的流程图。
具体实施方式
[0037]本专利技术提供了一种炭疽菌原生质体的制备方法，包括如下步骤：
[0038]将炭疽菌菌丝与酶解液混合，裂解，得到裂解液；
[0039]将所述裂解液培养3～8h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括炭疽菌原生质体；
[0040]所述酶解液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括磷酸缓冲液，所述溶质包括崩溃酶1～3wt.％和溶壁酶0.5～1wt.％。
[0041]在本专利技术中，所述炭疽菌优选包括植物炭疽菌，进一步优选包括山茶炭疽菌。本专利技术对所述山茶炭疽菌的菌株没有特殊限定，本领域中常规山茶炭疽菌菌株均可以采用本专利技术中的制备方法制备原生质体，如本专利技术实施例中采用的是山茶炭疽菌LS_19菌株。
[0042]本专利技术优选制备炭疽菌菌丝，所述炭疽菌菌丝的制备方法优选包括：
[0043]将活化的炭疽菌菌株接种至孢子培养基中进行孢子培养，得到分生孢子；
[0044]将所述分生孢子接种至菌丝培养基中进行菌丝培养，得到炭疽菌菌丝；所述菌丝培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～16h。
[0045]本专利技术优选将活化的炭疽菌菌株接种至孢子培养基中进行孢子培养，得到孢子培养液。本专利技术所述炭疽菌菌株的接种量与孢子培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种炭疽菌原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将炭疽菌菌丝与酶解液混合，裂解，得到裂解液；将所述裂解液培养3～8h，得到原生质体液，所述原生质体液中包括炭疽菌原生质体；所述酶解液包括溶剂和溶质，所述溶剂包括磷酸缓冲液，所述溶质包括崩溃酶1～3wt.％和溶壁酶0.5～1wt.％。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述炭疽菌原生质体在所述原生质体液中的浓度为(1.6～3.6)
×
107个/mL。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述裂解的震荡频率为80～120rpm，温度为28～32℃，时间为10～30min。4.根据权利要求1～3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述炭疽菌包括山茶炭疽菌。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述炭疽菌菌丝的制备方法包括：将活化的炭疽菌菌株接种至孢子培养基中进行孢子培养，得到分生孢子；将所述分生孢子接种至菌丝培养基中进行菌丝培养，得到炭疽菌菌丝；所述菌丝培养的震荡频率为150～200rpm，温度为25～28℃，时间为12～16h。6.权利要求1～5任一项所述的制备方法在构建炭疽菌遗传转化体系中的应用。7.一种炭疽菌遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：采用权利要求1～5任一项所述的制备方法制备得到炭疽菌原生质体；将...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕务云，蒋鸿，王玉春，曹清海，涂一怡，吴紫微，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：