一种简便快速检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种简便快速检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：利用糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体表达候选糖转运蛋白基因，碳源饥饿处理破坏跨酵母细胞膜质子电化学梯度，添加候选糖底物后检测能否重新构建跨膜质子梯度。若细胞外pH值显著下降，说明候选糖转运蛋白具有糖转运活性；反之则不具备糖转运活性。本发明专利技术在液体培养基中培养，以酵母胞外酸化判断目标基因的糖转运活性，从耗时、准确性、节省培养基和通量上比较，均优于目前常用的酵母生长互补检测。补检测。补检测。

【技术实现步骤摘要】
一种简便快速检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种简便快速检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法。

技术介绍

[0002]高等植物成熟叶片通过光合作用产生蔗糖，经过韧皮部长距离运输到花、根、种子和果实等库组织。跨膜糖转运蛋白主要包括SUT（Sucrose transporter）家族、MST（Monosaccharide transporter）家族和SWEET（Sugars will eventually be exported transporter）家族，介导蔗糖、葡萄糖和果糖等可溶性糖的跨膜转运。研究表明，跨膜糖转运蛋白对可溶性糖的积累至关重要，其作用不亚于可溶性糖代谢相关酶。SWEET家族是近十年来广泛研究的新型糖转运蛋白，其结构、转运机制和生理功能与此前已广泛研究的SUT及MST家族存在较大差别。园艺作物果实积累大量的可溶性糖，其含量和构成是决定其风味和商品价值的关键因素。基于公布的园艺作物基因组序列获得SWEET家族，其表达模式证明参与果实的可溶性糖积累，但对其糖转运活性的研究较为有限。
[0003]检测SWEET转运蛋白的糖转运底物类别和活性，是明确其生理功能的基础。通常借助异源系统表达重组蛋白，结合生长互补、放射性标记底物或糖感应子检测其底物类别和活性。例如，利用酵母糖吸收缺陷株系EBY.VW4000表达结合生长互补，检测西瓜ClSWEET3、玉米CST1和ZmSWEET4c、番茄SlSWEET1a、7a、葡萄VvSWEET4、黄瓜CsSWEET2、苜蓿MtSWEET1b、3c、5b、7和拟南芥AtSWEET4的糖转运活性；利用酵母表达结合放射性标记底物，检测西瓜ClSWEET3、玉米CST1、番茄SlSWEET1a和葡萄VvSWEET7的糖转运活性；利用爪蟾卵母细胞结合放射性同位素底物示踪进一步检测西瓜ClSWEET3的糖转运活性；利用HEK293T细胞系结合糖感应子，检测玉米CST1和 ZmSWEET4c、甜橙CsSWEET1、拟南芥AtSWEET1和百脉根LjSWEET3的糖转运活性。酵母缺陷株系的生长互补检测因其简单易操作和不需要大型仪器的优点，获得了最广泛的应用。但同时存在一些缺点，如生长所需时间较长，通常为2
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10天；难以定量比较，肉眼难以区分酵母微弱的生长和差异。因此，有必要改进酵母缺陷株系的生长互补检测方法，以达到缩短时间和精确定量的目的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点与不足，提供一种简便快速检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法。
[0005]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种简便快速检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法，包括如下步骤：利用糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体表达候选糖转运蛋白基因，碳源饥饿处理破坏跨酵母细胞膜质子电化学梯度，添加候选糖底物后检测能否重新构建跨膜质子梯度。若细胞外pH值显著下降，说明候选糖转运蛋白具有糖转运活性；反之则不具备糖转运活性。所述的糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体优选为酵母突变体EBY.VW4000。
[0006]本专利技术方法的原理：细胞正常的生理代谢需要跨膜质子电化学梯度，即质子浓度梯度（pH）及电位梯度，这是溶质跨膜次级主动运输的主要动力。正常生理条件下，细胞以葡萄糖等糖为碳源进行糖酵解，为代谢活动提供底物及ATP。形成的ATP驱动细胞膜质子泵向胞外泵出质子，形成跨膜质子电化学梯度。当细胞缺乏碳源时，糖酵解缺乏底物，无法构建跨膜质子电化学梯度。SWEET类蛋白转运的糖是细胞糖酵解的主要底物，因此可通过检测跨膜质子梯度（pH）判断SWEET蛋白的糖转运活性。
[0007]进一步地，所述的检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法，包括以下步骤：（1）构建候选糖转运蛋白基因的酵母表达载体。所述的载体优选为pDR196。
[0008]（2）将步骤（1）所构建的酵母表达载体转化到糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体中。
[0009]（3）步骤（2）获得的酵母菌株培养后收集细胞，进行碳饥饿处理。所述的碳饥饿处理优选为酵母细胞在无菌水或不含任何碳源的SC/
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ura培养基中30℃培养3小时。
[0010]（4）将碳饥饿处理的酵母细胞用候选糖作为唯一碳源、含有pH指示剂的液体培养基培养，根据培养液pH的变化确定候选糖转运蛋白基因的糖转运活性。所述的候选糖的终浓度优选为1
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2%；所述的培养的条件优选30℃培养3
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16小时。
[0011]所述的检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法，优选用溴甲酚紫（Bromocresol purple，BCP）作为pH指示剂。BCP具有以下特点：pH变色范围为5.2
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6.8，符合酵母生长所需要的环境；颜色由黄色变为蓝紫色，便于肉眼观察；不透过活细胞的细胞膜，不影响细胞生理代谢。BCP的终浓度优选为0.006
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0.01%。
[0012]目前普遍应用的酵母生长互补检测，通过酵母在含有不同碳源的固体培养基上生长情况来判断目标基因的糖转运活性。在目标基因能互补酵母生长的情况下，最短需要2天，长则需要10天，才能与对照进行定性比较。本专利技术相对于现有技术具有如下优点和有益效果：（1）本专利技术在液体培养基中培养，以酵母胞外酸化判断目标基因的糖转运活性，检测葡萄糖转运耗时仅约3 h，检测果糖转运耗时约16 h，耗时显著短于酵母生长互补检测。
[0013]（2）以BCP指示酵母胞外酸化判断候选基因的糖转运活性，既可定性判断，又可定量计算，定性判断无需借助仪器通过肉眼观察就能实现，定量计算时仅使用普通酶标仪即可，优于酵母生长互补检测。
[0014]（3）本专利技术基于酵母胞外酸化检测一些利用能力弱的糖的转运活性，其准确性优于酵母生长互补检测。
[0015]（4）本专利技术利用液体培养基培养结合酶标仪比色以检测目的基因糖转运活性，还具有节省培养基和通量高的优点。
附图说明
[0016]图1：BCP光吸收与pH值的关系及拟合曲线。（A）不同pH值下的BCP光吸收值；（B）BCP光吸收的比值R589/432与pH值的四参数逻辑拟合曲线。
[0017]图2：拟南芥AtSWEET1介导酵母EBY.VW4000的胞外酸化观察。分别添加2%葡萄糖或麦芽糖为碳源，以0.006%的BCP为pH指示剂，由紫色变为亮黄色表明pH降低。
[0018]图3：拟南芥AtSWEET1介导酵母EBY.VW4000胞外pH值变化检测。分别添加2%麦芽
糖、葡萄糖或果糖为碳源，以0.006%的BCP为pH指示剂。
[0019]图4：红肉火龙果HpSWEET1a和HpSWEET4a介导酵母EBY.VW4000的胞外酸化观察。0.006%的BCP为pH指示剂，由紫色变为亮黄色表明pH降低。
[0020]图5：红肉火龙果HpSWEET1a和HpSWEET4a介导酵母EBY.VW400本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：利用糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体表达候选糖转运蛋白基因，碳源饥饿处理破坏酵母细胞跨膜质子电化学梯度，添加候选糖底物后检测能否重新构建跨膜质子梯度；若细胞外pH值显著下降，说明候选糖转运蛋白具有糖转运活性；反之则不具备糖转运活性。2.根据权利要求1所述的检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）构建候选糖转运蛋白基因的酵母表达载体；（2）将步骤（1）所构建的酵母表达载体转化到糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体中；（3）步骤（2）获得的酵母菌株培养后收集细胞，进行碳饥饿处理；（4）将碳饥饿处理的酵母细胞用候选糖作为唯一碳源、含有pH指示剂的液体培养基培养，根据培养液pH的变化确定候选糖转运蛋白基因的糖转运活性。3.根据权利要求1或2所述的检测SWEET类蛋白糖转运活性的方法，其特征在于：所述的糖转运蛋白敲除的酿酒酵母突变体为酵母突变体EBY.VW4000。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑乾明，王小柯，王红林，解璞，
申请(专利权)人：贵州省果树科学研究所贵州省柑橘研究所，贵州省特色果蔬工程技术中心，贵州省火龙果研究所，
类型：发明
国别省市：