一种酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人工酶，该人工酶基于天然酶的序列改良制得，该天然酶具有催化如下所示的从化合物Ⅰ(尼古丁)转变成化合物Ⅱ(N

【技术实现步骤摘要】
一种酶及其应用


[0001]本专利技术属于蛋白质工程领域，涉及一种蛋白质突变体，尤其涉及一种尼古丁脱氢酶突变体，及其在开发治疗尼古丁成瘾方面蛋白质药物等方面的应用。

技术介绍

[0002]尼古丁(Nicotine，1
‑
甲基
‑2‑
[3
‑
吡啶]‑
吡咯烷)是烟叶、卷烟烟气及烟草废弃物中的主要有害成分之一，不仅直接有害于健康，而且是烟草中主要致癌成分烟草特有亚硝胺(TSNA)的重要前体物。我国烟叶生产中每年都有大量的高尼古丁烟叶产生，不仅严重影响了烟叶的吸昧品质，而且增加了烟叶的有害性。降低烟草和环境中尼古丁的含量，对于维护人类的健康和保护生态环境有着极为重要的意义。
[0003]利用微生物降解尼古丁是降低烟叶和环境中尼古丁含量和有害性的一条新途径，特别是假单胞菌属(Pseudomonas)和节杆菌属(Arthrobacter)能将尼古丁代谢分解以产生其生长所必需的碳源、氮源及能量。已发现的可代谢尼古丁的细菌有假单胞菌属(如Pseudomonas sp.No.41，P.convexa PC1，P.putida)、节杆菌属(如Arthobacter oxidans P
‑
34，后来重新鉴定为A.ureafaciens；A.oxidans pAO1，后来重新鉴定为Arthrobacter nicotinoborans)、纤维单胞菌属(Cellulomonas sp.)以及苍白杆菌属(Ochrobactrum intermedium)。真菌主要有刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、钝顶螺旋藻(S.platenses)和丝核薄膜革菌(Pelliculariafilamentosa)。
[0004]已经发现微生物代谢尼古丁主要通过3种途径：吡啶环途径(Pyridine pathway)，主要以节杆菌(Arthrobacter sp.)为主；吡咯环途径(Pyrrolidine pathway)，主要以假单胞菌属(Pseudomonas sp.)为主；去甲基化途径(Me pathway)，主要存在于真菌当中。在吡咯环途径中，尼古丁的吡咯环被氧化，生成甲基麦斯明烟草碱(methylmyosmine)，当加入水后，甲基麦斯明烟草碱开环形成假氧化型尼古丁，进而去甲基化，形成3
‑
羧酸吡啶盐，吡啶环的6
’
位置再羟基化，形成6
‑
羟,3
‑
羧酸吡啶盐，脱去侧链形成2,5
‑
二羟基
‑
吡啶盐和琥珀酸盐。此代谢途径也可从6
‑
羟
‑
假氧化型尼古丁开始，最终仍生成2,5
‑
二羟基
‑
吡啶盐和琥珀酸盐。
[0005]尼古丁脱氢酶NicA2是最近从恶臭假单胞菌S16(Pseudomonas putida S16)分离出的能降解尼古丁的酶。有关尼古丁脱氢酶NicA2的报道可参见：PLoS Genet.2013Oct；9(10):e1003923.doi:10.1371/journal.pgen.1003923.Epub 2013Oct 24.Systematic unraveling of the unsolved pathway of nicotine degradation in Pseudomonas.Tang H,Wang L,Wang W,Yu H,Zhang K,Yao Y,Xu P。
[0006]尼古丁脱氢酶NicA2催化尼古丁降解第一步的脱氢反应，将尼古丁(I)转化为N
‑
甲基唛喔思明(N
‑
methymyosmine)(II)，N
‑
甲基唛喔思明可进一步自发水合生成假氧化尼古丁(pseudooxynicotine)(III)。
[0007][0008]NicA2由nicA2基因编码，在恶臭假单胞菌S16(Pseudomonas putida S16)代谢尼古丁的降解途径中发挥至关重要的作用，敲除nicA2基因，则恶臭假单胞菌S16无法以尼古丁作为唯一的碳氮源生长(PLoS Genet.10.1371/journal.pgen.1003923)。
[0009]NicA2隶属于单胺氧化酶(monoamine oxidase,MAO)家族，MAO主要存在于线粒体外膜上，其在机体内的主要作用是催化内源性和外源性单胺类物质的代谢，在MAO的作用下单胺类物质被氧化而产生脱氨基作用。根据MAO的作用底物、分布位置和选择性抑制剂不同，可将MAO分成两类，即MAO
‑
A和MAO
‑
B。MAO
‑
A对5
‑
羟色胺(5
‑
HT)、去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)具有高亲和性(J.Mol.Biol.338,103
–
114)；而MAO
‑
B对苯乙基胺(PEA)、苯甲胺等具有高亲和性(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100,9750
–
9755)。
[0010]NicA2在恶臭假单胞菌降解尼古丁的起始，其催化尼古丁并生成假氧化尼古丁，为整条代谢途径的顺畅进行提供了起始的动力。许平课题组对尼古丁代谢通路的研究已经证实了后续的6
‑
羟基
‑3‑
琥珀酰吡啶单加氧酶(HspB)和2,5
‑
二羟基吡啶双加氧酶(HPO)可以进一步催化尼古丁脱酸、开环，进而形成简单的结构，最终进入三羧酸循环(J.Biol.Chem.42:29158
–
29170；Sci.Rep./3
‑
3235/DOI:10.1038/srep03235)。所以说，NicA2对尼古丁的第一步加工，开启了后续的酶催化乃至整条代谢途径的高效运行，NicA2催化效率的高低，是决定整条尼古丁代谢效率的关键点，也是后续代谢途径构建的重要所在。2015年发表在《JACS》上的《A new strategy for smoking cessation:characterization of a bacterial enzyme for the degradation of nicotine》一文首次报道了NicA2对于治疗香烟成瘾的可能性。该文指出，NicA2对于底物尼古丁的催化具有高效性和稳定性，即使在鼠血清中，37℃下也能维持较高的活性。同时，NicA2对于底物尼古丁具有高亲和性，它催化尼古丁降解的Km值为91.9nM，而血液中的尼古丁最高含量在162
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370nM之间，所以理论上，如果NicA2能成功在人体内发挥降解尼古丁的作用，那么人体中的尼古丁含量对于NicA2来说本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工酶，所述人工酶基于天然酶的序列改良制得，所述天然酶具有催化如下所示的从化合物Ⅰ转变成化合物Ⅱ的反应的活性，或者，...

【专利技术属性】
技术研发人员：许平，唐鸿志，张坤智，吴更，陶飞，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：