用于研究NDVRNA编辑特性的微型基因组系统及差异性表达两种外源基因的方法技术方案

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及用于研究NDVRNA编辑特性的微型基因组系统及差异性表达两种外源基因的方法。本发明专利技术提供的重组基因在NDV中可产生多个转录本，并且使两种目标基因的表达产生恒定比例的差异，编辑位点上游目标基因与编辑位点下游目标基因转录本的比例约为4：1。1。1。

【技术实现步骤摘要】
用于研究NDV RNA编辑特性的微型基因组系统及差异性表达两种外源基因的方法


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及用于研究NDV RNA编辑特性的微型基因组系统及差异性表达两种外源基因的方法。

技术介绍

[0002]新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的以感染禽类为主的一种急性、高度接触性传染病。该病以消化道和呼吸道病变为主要特征，发病率和死亡率高，给养禽业带来了严重的危害。NDV基因组编码6种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白(NP)、磷酸化蛋白(P)、基质蛋白、融合蛋白、血凝素
‑
神经氨酸酶蛋白和RNA依赖性RNA聚合酶(L)和2种非结构蛋白，分别为V蛋白和W蛋白。其非结构蛋白的产生主要是P基因在转录过程中病毒RNA聚合酶(RdRp)在编辑位点(Editing site，ES，其特异序列为“AAAAAGGG”(A5G3))发生短暂的停顿，非模板依赖性地插入1个鸟嘌呤(+1G)和2个鸟嘌呤(+2G)。目前对RNA编辑现象的检测手段主要是通过高通量测序，这种方法敏感性较高，但是其成本也较高，不便利，因此使用微型基因系统通过荧光显微镜即可观察到是否存在RNA编辑现象，可以用于研究RNA编辑位点的特性。在NDV载体上利用其RNA编辑功能恒定比例地差异性表达多种外源基因技术，在疫苗、肿瘤或基因治疗及外源基因表达方式等领域有重要的应用价值。然而现有技术主要是通过将两种或多种外源基因插入NDV基因组的不同位置对外源基因实现其差异表达，但是其差异并不明显，且两者的差异性不是恒定的比例。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于解决现有技术的不足，提供用于研究NDV RNA编辑特性的微型基因组系统及利用NDV RNA编辑功能差异性表达两种外源基因的方法，以恒定比例差异表达不同蛋白。
[0004]本专利技术提供了一种重组基因，包括基因Ⅰ、编辑位点、额外碱基a、终止密码子、额外碱基b、基因Ⅱ和额外碱基c；
[0005]所述基因Ⅰ、编辑位点、额外碱基a、终止密码子、额外碱基b、基因Ⅱ和额外碱基c顺次连接；
[0006]所述基因Ⅰ和基因Ⅱ编码不同的蛋白；
[0007]所述编辑位点的核苷酸序列为5
’‑
AAAAAGGG
‑3’
。
[0008]优选的，所述基因Ⅰ下游和编辑位点的上游之间插有侧翼6nt；所述侧翼6nt的核苷酸序列为5
’‑
GTCATC
‑3’
或5
’‑
AATGCT
‑3’
。
[0009]优选的，所述基因Ⅰ或基因Ⅱ包括荧光基因或萤光素酶基因；所述荧光基因包括eGFP、RFP、mCherry、DsRed或BFP；所述萤光素酶基因包括Fluc或Rluc。
[0010]本专利技术还提供了上述技术方案所述的重组基因在构建基因差异表达系统中的应用。
[0011]本专利技术还提供了一种用于研究NDV RNA编辑位点特性的微型基因组系统，所述微型基因组系统的元件包括Promoter，Leader，GS和3
’
UTR，上述技术方案所述的重组基因，5
’
UTR，GE，Trailer和Terminator。
[0012]本专利技术还提供了一种差异性表达两种外源基因的方法，包括如下步骤：
[0013]将上述技术方案所述的微型基因组系统与辅助质粒混合，共转染细胞。
[0014]优选的，所述辅助质粒包括pCAGGS
‑
T7、pCAGGS
‑
NP、pCAGGS
‑
P和pCAGGS
‑
L；所述细胞包括BHK
‑
21细胞。
[0015]本专利技术还提供了上述技术方案所述的重组基因或上述技术方案所述的微型基因组系统在制备差异表达两种外源基因的元件中的应用。
[0016]本专利技术还提供了一种重组病毒，在NDV基因组的P基因和M基因之间插入上述技术方案所述的重组基因。
[0017]本专利技术提供了一种重组基因，包括基因Ⅰ、编辑位点、额外碱基a、终止密码子、额外碱基b、基因Ⅱ和额外碱基c；所述基因Ⅰ、编辑位点、额外碱基a、终止密码子、额外碱基b、基因Ⅱ和额外碱基c顺次连接；所述基因Ⅰ和基因Ⅱ编码不同的蛋白；所述编辑位点的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本专利技术所述编辑位点为新城疫病毒(NDV)在转录过程中病毒RNA聚合酶(RdRp)的识别位点，在转录过程中在本专利技术所述编辑位点处发生短暂的停顿，非模板依赖性地插入1个鸟嘌呤(+1G)和2个鸟嘌呤(+2G)，可产生多个转录本，并且使不同目标基因的表达产生恒定比例的差异，编辑位点上游目标基因与编辑位点下游目标基因转录本的比例约为4：1。
[0018]进一步的，本专利技术限定所述编辑位点上游侧翼6nt核苷酸序列，能够进一步提高编辑频率。
附图说明
[0019]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0020]图1为实施例1
‑
1中表达含有双荧光报告基因的MG质粒的构建示意图；
[0021]图2为实施例2
‑
1中对NDV不同基因型P基因ES上游侧翼碱基的保守性分析结果；
[0022]图3为测试例1荧光检测结果；
[0023]图4为测试例2中定量检测ES上游侧翼6nt对RNA编辑频率的影响结果，其中**表示差异极显著，P＜0.01，***表示差异极显著，P＜0.001；
[0024]图5为实施例3中NDV强毒株JS/17反向遗传学系统的图谱；
[0025]图6为实施例3中JS
‑
Δ6P
HA
‑
eGFP、rJS
‑
P
HA
‑
eGFP在BHK
‑
21细胞上的增殖能力；
[0026]图7为实施例3中rJS
‑
P
HA
‑
eGFP和rJS
‑
Δ6P
HA
‑
eGFP质粒构建示意图；
[0027]图8为实施例3中重组病毒感染细胞后P/V/W的表达情况；
[0028]图9为实施例4中表达含有ES以及侧翼碱基的外源基因的重组病毒构建结果；
[0029]图10
‑
1和图10
‑
2为实施例4中ES侧翼碱基对外源基因差异表达的影响；
[0030]图11为实施例5中病毒感染后不同时间点各个转录本的情况；
[0031]图12为实施例5中各个转录本的表达比例。
具体实施方式
[0032]本专利技术提供了一种重组基因，包括基因Ⅰ、编辑位点、额外碱基a、终止密码子、额外碱基b、基因Ⅱ和额外碱基c本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组基因，其特征在于，包括基因Ⅰ、编辑位点、额外碱基a、终止密码子、额外碱基b、基因Ⅱ和额外碱基c；所述基因Ⅰ、编辑位点、额外碱基a、终止密码子、额外碱基b、基因Ⅱ和额外碱基c顺次连接；所述基因Ⅰ和基因Ⅱ编码不同的蛋白；所述编辑位点的核苷酸序列为5
’‑
AAAAAGGG
‑3’
。2.根据权利要求1所述的重组基因，其特征在于，所述基因Ⅰ下游和编辑位点的上游之间插有侧翼6nt；所述侧翼6nt的核苷酸序列为5
’‑
GTCATC
‑3’
或5
’‑
AATGCT
‑3’
。3.根据权利要求1所述的重组基因，其特征在于，所述基因Ⅰ或基因Ⅱ包括荧光基因或萤光素酶基因；所述荧光基因包括eGFP、RFP、mCherry、DsRed或BFP；所述萤光素酶基因包括Fluc或Rluc。4.权利要求1～3任一项所述的重组基因在构建基因差异表达系统中的应用。5.一种用于研究NDV RN...

【专利技术属性】
技术研发人员：萧飒，孟繁星，田健霞，杨增岐，刘海金，党如意，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：