一种高效嗜热基因打靶系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供了一种新的基于嗜热II型内含子的高效嗜热基因打靶系统。所述打靶系统由嗜热II型内含子RNA和内含子编码蛋白（IEP）组成。所述内含子RNA序列包含四个特征性的外显子识别序列EBS2、EBS2b、EBS1和EBS3；靶位点上包含四个特征性的内含子结合序列IBS2、IBS2b、IBS1和IBS3。所述外显子识别序列与所述内含子结合序列通过碱基互补配对相互识别，形成EBS2/IBS2，EBS2b/IBS2b，EBS1/IBS1和EBS3/IBS3配对，确定系统在染色体上的打靶位点，进而实现靶位点的敲除。所述的打靶系统中，增加了一个内含子RNA关键识别位点EBS2b/IBS2b位点；通过该位点的配对，将打靶成功率提高至原来的4

【技术实现步骤摘要】
一种高效嗜热基因打靶系统及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学与微生物学领域，涉及一种在微生物中应用的基因打靶系统，具体涉及一种高效嗜热基因打靶系统。

技术介绍

[0002]嗜热微生物在生物能源、生物冶炼、生物降解、工业酶生产等众多领域具有重要功能。开发高效便捷的嗜热遗传改造系统，对于加快嗜热微生物在工、农、医药、环保等领域的研究和应用具有重要价值和意义。尽管CRISPR
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Cas9相关的遗传操作系统具有强大的基因编辑功能，但该系统不适用于嗜热微生物的遗传改造。因此，如何实现嗜热微生物高效便捷的遗传改造，是亟待解决的问题。
[0003]为解决这一问题，Thermotargetron基因打靶系统应运而生，专利技术专利201410155715.4公开了“一种适用于嗜热微生物遗传改造的基因元件及其载体和应用”。所述的Thermotargetron基因打靶系统，是基于嗜热II型内含子构建的嗜热基因打靶系统，具有耐高温特点，目前已应用于嗜热微生物的遗传改造。该系统来源于嗜热蓝细菌(Thermosynechococcus elongatus)的嗜热II型内含子Tel3c/4c，其在高温条件下具有较好的“归巢”效率。该系统主要由内含子RNA(intron RNA)和内含子编码蛋白(intron encoded protein，IEP)两大功能元件组成。其基本原理是利用内含子RNA的核酶活性，通过碱基互补配对原则识别并切割DNA靶位点，然后利用IEP蛋白的反转录活性将内含子RNA通过反转录整合到DNA靶位点，实现嗜热II型内含子在染色体上的“归巢”，从而达到基因失活的目的(附图1)。
[0004]Thermotargetron基因打靶系统中，嗜热II型内含子与靶基因位点的精确识别是实现高效基因打靶的关键。嗜热II型内含子RNA的三个外显子结合序列(EBS2、EBS1、EBS3)与靶基因位点的三个内含子结合序列(IBS2、IBS1、IBS3)通过碱基互补配相互识别(附图2)。其中，识别位点具有如下特征：A(
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15)A(
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14)xxxxxxxxxxxxxA(+1)，其中A(+1)表示内含子RNA插入位点下游的第1个碱基为A，A(
‑
15)和A(
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14)则表示内含子RNA插入位点上游的第14和第15两个位点碱基为A，13个x表示打靶位点的13个碱基。因此，通过设计内含子RNA的三个识别序列，即可实现在不同基因位点的打靶。
[0005]目前，Thermotargetron基因打靶系统的打靶成功率约为1
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30％(针对不同基因和不同物种打靶效率差别很大)。如果提高其打靶成功率，则可以大大提高遗传改造的效率，具有重要的应用价值。但目前尚未见相关报道。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中Thermotargetron基因打靶系统打靶效率有待提高的现状，本专利技术提供了一种新的基于嗜热II型内含子的高效嗜热基因打靶系统。该系统通过增加新的靶序列识别位点(EBS2b/IBS2b)，实现了打靶成功率的极大提高，为嗜热微生物或短暂耐高温微生物的遗传改造提供了更高效的基因打靶工具。
[0007]本专利技术的技术方案：
[0008]用于高效嗜热基因打靶系统的靶位点DNA识别序列，所述靶位点DNA识别序列由如下结构组成：A(
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15)A(
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14)xxxxxX(
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8)xxxxxxxNA(+1)。其中，A(+1)表示靶位点下游的第1个碱基为A，A(
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15)和A(
‑
14)表示靶位点上游的第14和第15两个位点碱基为A；X(
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8)表示靶位点上游的第8个位点IBS2b，所述IBS2b位点与内含子RNA的EBS2b位点互补配对；x表示与内含子RNA相互识别的碱基，N表示靶位点。靶位点上游的第7个位点x为IBS1，所述IBS1位点与内含子RNA的EBS1位点互补配对；靶位点上游的第6个位点x为IBS2，所述IBS2位点与内含子RNA的EBS2位点互补配对；靶位点上游的第5个位点x为IBS3，所述IBS3位点与内含子RNA的EBS3位点互补配对。所述识别位点IBS2b、IBS1、IBS2和IBS3均为A、T、G、C四个碱基中的任意一个。通过增加与内含子RNA的EBS2b位点互补配对的第8个位点IBS2b，所述靶位点DNA识别序列识别的靶位点的打靶成功率得以大大提升。
[0009]一种表达载体，含有如前所述的靶位点DNA识别序列的表达载体。
[0010]如前所述的靶位点DNA识别序列的应用，用于高效嗜热基因打靶系统中靶位点的识别，进而使得靶位点被敲除。
[0011]一种高效嗜热基因打靶系统，所述打靶系统由嗜热II型内含子RNA和内含子编码蛋白(IEP)组成。其中，所述内含子RNA序列包含四个特征性的外显子识别序列EBS2、EBS2b、EBS1和EBS3；靶位点上包含四个特征性的内含子结合序列IBS2、IBS2b、IBS1和IBS3。所述外显子识别序列与所述内含子结合序列通过碱基互补配对相互识别，形成EBS2/IBS2，EBS2b/IBS2b，EBS1/IBS1和EBS3/IBS3配对，确定系统在染色体上的打靶位点，进而实现靶位点的敲除(附图3)。所述打靶系统用于嗜热微生物和可短暂耐高温的中温微生物。其中，所述嗜热微生物是指最适生长温度高于45℃的微生物；所述可短暂耐受高温微生物是指能够短暂耐受45℃及以上温度的微生物。所述的打靶系统，在原有嗜热II型内含子打靶系统的基础上增加了一个内含子RNA关键识别位点，即EBS2b/IBS2b位点；通过该位点的配对，极大提高了基因打靶成功率，与原系统相比，提高了4
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5倍。如前所述的高效嗜热基因打靶系统的使用方法，包括以下步骤：
[0012](1)筛选打靶位点：根据权利要求2所述的靶位点DNA识别序列筛选打靶位点；
[0013](2)设计打靶引物：根据步骤(1)筛选的打靶位点设计打靶引物，改变内含子RNA上的四个特征性外显子识别序列，实现对打靶位点的识别；
[0014]其中，步骤(2)所述的打靶引物为：
[0015]Tel3c
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UNV：TAACGAGGCTTCTAGCG；
[0016]IBS12：
[0017]EBS2：CGCTAGAAGCCTCGTTXxxxxxAGCAGGCCAAAGATGCTG；
[0018]EBS1a：CGGAGTTGCTGTCCCCGTACGCTGAxxxxxxAGCAGCGTATCCAATCC；
[0019]引物Tel3c
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UNV为通用引物；引物IBS12中的xxxxx与引物EBS2中的5个x相互识别形成EBS2/IBS2配对；引物IBS12中的大写X与引物EBS2中的大写X相互识别形成EBS2b/IBS2b配对；引物I本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于高效嗜热基因打靶系统的靶位点DNA识别序列，其特征在于：所述靶位点DNA识别序列由如下结构组成：A(
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15)A(
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14)xxxxxX(
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8)xxxxxxxNA(+1)；其中，A(+1)表示靶位点下游的第1个碱基为A，A(
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15)和A(
‑
14)表示靶位点上游的第14和第15两个位点碱基为A；X(
‑
8)表示靶位点上游的第8个位点IBS2b，所述IBS2b位点与内含子RNA的EBS2b位点互补配对；x表示与内含子RNA相互识别的碱基，N表示靶位点。2.根据权利要求1所述的靶位点DNA识别序列，其特征在于：靶位点上游的第7个位点x为IBS1，所述IBS1位点与内含子RNA的EBS1位点互补配对；靶位点上游的第6个位点x为IBS2，所述IBS2位点与内含子RNA的EBS2位点互补配对；靶位点上游的第5个位点x为IBS3，所述IBS3位点与内含子RNA的EBS3位点互补配对。3.根据权利要求1或2所述的靶位点DNA识别序列，其特征在于：所述识别位点IBS2b、IBS1、IBS2和IBS3均为A、T、G、C四个碱基中的任意一个。4.一种表达载体，其特征在于：含有权利要求1
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3中任意一项所述的靶位点DNA识别序列的表达载体。5.如权利要求1
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3中任意一项所述的靶位点DNA识别序列的应用，其特征在于：用于高效嗜热基因打靶系统中靶位点的识别，进而使得靶位点被敲除。6.高效嗜热基因打靶系统，其特征在于：所述打靶系统由嗜热II型内含子RNA和内含子编码蛋白（IEP）组成；其中，所述内含子RNA序列包含四个特征性的外显子识别序列EBS2、EBS2b、EBS1和EBS3；靶位点上包含四个特征性的内含子结合序列IBS2、IBS2b、IBS1和IBS3，所述外显子识别序列与所述内含子结合序列通过碱基互补配对相互识别，形成EBS2/IBS2，EBS2b/IBS2b，EBS1/IBS1和EBS3/IBS3配对，确定系统在染色体上的打靶位点，进而实现靶...

【专利技术属性】
技术研发人员：洪伟，崔古贞，赵行行，花登雄，刘亚君，齐晓岚，陈峥宏，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：