一株热带芽孢杆菌CSN-15菌株及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物工程技术领域，提供了一株产壳聚糖酶的微生物菌株，特别是涉及一株热带芽孢杆菌，及利用该菌生产壳聚糖酶和利用该酶生产壳寡糖的方法。本发明专利技术通过对从海泥样品筛选，对其中得到的产壳聚糖酶菌株CSN

【技术实现步骤摘要】
一株热带芽孢杆菌CSN
‑
15菌株及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，提供了一株产壳聚糖酶的微生物菌株，特别是涉及一株热带芽孢杆菌，及利用该菌生产壳聚糖酶和利用该酶生产壳寡糖的方法。

技术介绍

[0002]壳聚糖是唯一的天然碱性多糖，但因为分子量大，难溶于水，其开发利用受到严重的限制。随着对壳聚糖的研究，发现以壳聚糖为原料制备的壳寡糖，具有抗炎、抗癌、抗肿瘤等作用，在食品、医药、保健品、化工等诸多领域均有良好的应用。壳寡糖，又可称为壳聚寡糖，是经由壳聚糖降解得到的聚合度在2
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20之间的寡糖产品，比起壳聚糖，壳寡糖具有水溶性更好，生物活性更高，更容易被生物体吸收利用等优势。制备壳寡糖的传统制备方法包括物理法、化学法。物理方法操作较为简单且易于控制，主要应用包括超声波降解法、微波降解法等。但物理方法制备壳寡糖虽然反应温和，操作简单，但生产效率相对较低，并且无法得到目的聚合度的壳寡糖，也容易造成原料的浪费。化学法主要是运用各种试剂通过化学反应来达到目的，是最初制备壳寡糖最常用以及应用最广泛的方法，根据所选试剂不同，又可将化学法分为氧化降解法及酸降解法。但氧化降解法不仅影响产物外观，还会对后续产物的提纯和优化带来一定的浓度。而酸降解法中的高温高压反应条件过于苛刻，难以控制，严重影响该方法的应用。
[0003]随着糖生物学的不断深入发展，壳寡糖被进一步开发利用，在农业、食品、医药与医用材料等领域均有研究价值，带来极大的经济效益。近年来，国内外关于壳聚糖微生物发酵酶解法获得壳寡糖的研究工作也十分活跃。目前在制备壳寡糖时，研究人员大多采用酶法水解壳聚糖，因为此反应具有高效，产物均一无污染等特点。但是，由于缺乏对高活力、高稳定性和低成本的壳聚糖酶的开发，无法满足商业上对高活性的壳聚糖酶的需求，该行业的发展受到了一定的限制。因此，开发高活力、高稳定性和低成本的壳聚糖酶生产方法显得尤为重要。

技术实现思路

[0004]本专利技术针对上述技术存在的不足，通过对从海泥样品筛选，得到的一株产壳聚糖酶菌株CSN
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15，该菌株能够生产较高活力的壳聚糖酶，并应用于壳聚糖酶的降解。
[0005]一种热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)CSN
‑
15，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌号为CGMCC 24948。
[0006]热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)CSN
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15的获得：
[0007]于连云港海州湾燕尾港海域(34
°
29
′0″
N，119
°
47
′0″
E)采集海泥样品，称取1g海泥样品，加入到9mL无菌水中，用玻璃棒搅拌约20min，使样品与无菌水充分混合，将其进行10倍浓度梯度稀释。稀释为10
‑4、10
‑5、10
‑6的稀释梯度；
[0008]将稀释液倒到筛选培养基上，每种浓度分别涂布三个平板。在28℃下培养7d，观察筛选培养基上菌落周围有无变色圈产生以及菌落的生长情况；
[0009]挑取长势最好的菌株作为后续研究对象，将其命名为CSN
‑
15，在LB培养基平板上进行多次划线分离纯化培养；
[0010]将单菌落接种在斜面培养基上并进行纯培养，在28℃培养箱中培养2d后，移入
‑
80℃的冰箱内保存备用。
[0011]本专利技术所获得的热带芽孢杆菌CSN
‑
15用于发酵生产壳聚糖酶。
[0012]本专利技术提供所获得的热带芽孢杆菌CSN
‑
15用于发酵生产壳聚糖酶方法，具体步骤如下：
[0013](1)菌种活化：将
‑
80℃保藏的热带芽孢杆菌CSN
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15三区划线至LB固体培养基上进行活化；
[0014](2)种子培养液制备：在在无菌条件下，将活化的菌株挑取到种子培养基上培养获得种子培养液；
[0015](3)发酵产酶：种子培养液接种于发酵培养基中，进行发酵培养，离心收集上清液，即为壳聚糖酶的粗酶液。
[0016]步骤(1)中菌种活化条件为28℃下活化24h。
[0017]步骤(2)中种子培养条件为28℃、180r/min条件下摇瓶培养12～18h。
[0018]步骤(3)中的接种比例为按5％(V/V)，发酵产酶条件为28℃，180rpm条件下进行发酵培养48小时。
[0019]本专利技术所获得的壳聚糖酶对壳聚糖水解生产壳寡糖的方法：壳聚糖酶粗酶液1ml与50ml的12％胶体壳聚糖溶液混合，于35℃水浴锅反应60min，即可完全降解壳聚糖获得壳寡糖。
[0020]优选地，所述的12％胶体壳聚糖溶液配制方法为：将12g的壳聚糖粉末溶于90ml，浓度为2％的乙酸溶液中，加入适量的碱性溶液(1％的乙酸钠溶液)，校正pH 5.0，容量瓶补充水至100ml，即为12％胶体壳聚糖。
[0021]本专利技术的有益效果：相较于目前普遍应用的壳聚糖酶，CSN
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15菌株产生的壳聚糖酶活性较高，酶活性为4.28U/ml。该壳聚糖酶的最适pH为5.0、最适温度为35℃，且壳聚糖添加量对酶的活性没有影响。此外，该酶的催化时间较短，1h获得的壳寡糖产率较高，占总产物的83％。
附图说明
[0022]图1：筛选培养基透明圈
[0023]图2：葡萄糖标准曲线
[0024]图3：SDS凝胶电泳图及活性染色图，1:Marker；2：空白组；3：实验组(不加壳聚糖)；4：实验组(加入壳聚糖)；5：活性染色
[0025]图4：pH对CSN
‑
15壳聚糖酶酶活性影响
[0026]图5：温度对CSN
‑
15壳聚糖酶酶活性影响
[0027]图6：CSN
‑
15壳聚糖酶水解壳聚糖结果图，A对照组(不含粗酶液)，B为实验组(含粗酶液)
[0028]图7：壳聚糖酶解产物薄层层析结果
具体实施方式
[0029]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。
[0030]实施例1菌株筛选
[0031]于连云港海州湾燕尾港海域(34
°
29
′0″
N，119
°
47
′0″
E)采集海泥样品，称取1g海泥样品，加入到9mL无菌水中，用玻璃棒搅拌约20min，使样品与无菌水充分混合，将其进行10倍浓度梯度稀释。稀释为10
‑4、10
‑5、10
‑6等不同的稀释度后，将稀释液倒到筛选培养基上，每种浓度分别涂布三个平板。在28℃下培养7d，观察筛选培养基上菌落周围有无变色圈产生以及菌落的生长情本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种热带芽孢杆菌(Bacillus tropicus)CSN
‑
15，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏菌号为CGMCC 24948。2.如权利要求1所述的热带芽孢杆菌CSN
‑
15的获得方法包括以下步骤：于连云港海州湾燕尾港海域(34
°
29
′0″
N，119
°
47
′0″
E)采集海泥样品，称取1g海泥样品，加入到9mL无菌水中，用玻璃棒搅拌约20min，使样品与无菌水充分混合，将其进行10倍浓度梯度稀释，稀释为10
‑4、10
‑5、10
‑6的稀释梯度；将稀释液倒到筛选培养基上，每种浓度分别涂布三个平板，在28℃下培养7d，观察筛选培养基上菌落周围有无变色圈产生以及菌落的生长情况；挑取长势最好的菌株作为后续研究对象，将其命名为CSN
‑
15，在LB培养基平板上进行多次划线分离纯化培养；将单菌落接种在斜面培养基上并进行纯培养，在28℃培养箱中培养2d后，移入
‑
80℃的冰箱内保存备用。3.如权利要求1所述的热带芽孢杆菌CSN
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15用于发酵生产壳聚糖酶。4.如权利要求1所述的热带芽孢杆菌CSN
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15用于发...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光，王毓涵，苏彦文，东倬含，耿晓萌，房耀维，侯晓月，刘姝，
申请(专利权)人：江苏海洋大学，
类型：发明
国别省市：