有机酸的定量检测方法技术

本发明专利技术提供了一种有机酸的定量检测方法，涉及检测技术领域。本发明专利技术提供的有机酸的定量检测方法，包括：将待测样品进行衍生化处理和添加内标溶液后，采用液相色谱

【技术实现步骤摘要】
有机酸的定量检测方法


[0001]本专利技术涉及检测
，尤其是涉及一种有机酸的定量检测方法。

技术介绍

[0002]三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle，TCAcycle)是需氧生物体内普遍存在的代谢途径。原核生物中分布于细胞质，真核生物中分布在线粒体。三羧酸循环是三大营养素(糖类、脂类、氨基酸)的最终代谢通路，又是糖类、脂类、氨基酸代谢联系的枢纽。三羧酸循环也是机体将糖或其他物质氧化而获得能量的最有效方式。在糖代谢中，糖经此途径氧化产生的能量最多。三羧酸循环在所有生命体中的起着重要作用，越来越受到重视。因此，三羧酸循环中的有机酸的检测需求增加，而在做有机酸检测时，发现这类物质含有同分异构体，且同分异构体在检测时分离度差甚至难以分开，有的物质检测灵敏度低，不能满足检测要求。
[0003]常用的质谱检测手段会出现同分异构体分离度差甚至无法分开，而且有个别物质的灵敏度低，定量限高无法满足检测要求，同位素内标价格高且并不是每个标品都可以买到同位素，内标内源性物质基质效应测试困难。
[0004]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种有机酸的定量检测方法，以解决上述问题中的至少一种。
[0006]第一方面，本专利技术提供了一种有机酸的定量检测方法，包括以下步骤：将待测样品进行衍生化处理和添加内标溶液后，采用高效液相色谱
‑
串联质谱法对样品中的有机酸进行定量分析；
[0007]所述衍生化处理包括：采用3
‑
硝基苯肼对样品中的有机酸进行衍生化反应；
[0008]所述内标溶液包括采用C13
‑3‑
硝基苯肼衍生化处理的有机酸；
[0009]所述有机酸包括：衣康酸、柠康酸、中康酸、L
‑
乳酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、延胡索酸、乌头酸、酮戊二酸、丙酮酸和草酰乙酸；
[0010]所述高效液相色谱的条件包括：
[0011]色谱柱：waters HSS T3 2.1*150mm、Waters BEH C18 2.1*100mm或waters HSS T3 2.1*100mm；
[0012]流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈；
[0013]洗脱程序：0
‑
1min 40％流动相B，1
‑
3.5min流动相B逐渐升至60％，3.5
‑
8.5min流动相B逐渐升至75％，8.5
‑
11.5min流动相B逐渐升至100％，11.5
‑
13.5 100％流动相B，13.5
‑
14min流动相B逐渐降至40％，14
‑
16min 40％流动相B；
[0014]所述质谱的条件包括：电喷雾电离源，离子源温度350300
‑
400℃，离子源电压负/正模式
‑
2500V/3500V，鞘气35(
‑
2500～
‑
3000V)/(3500～4000V)，鞘气30
‑
40psi，辅助气
105
‑
15psi，碰撞气1.5
‑
2psi，采用多重反应监测进行扫描。
[0015]作为进一步技术方案，所述衍生化处理为在催化剂和活化剂存在的情况下进行衍生化反应；
[0016]所述催化剂包括吡啶、4
‑
二甲氨基吡啶或乙酸；
[0017]所述活化剂包括N
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
N＇
‑
乙基碳二亚胺；
[0018]所述衍生化反应的介质包括甲醇水溶液；
[0019]所述衍生化反应的体系中，3
‑
硝基苯肼或C13
‑3‑
硝基苯肼的浓度为2.5
‑
50mmol，催化剂的体积浓度为0.1％
‑
5％，活化剂的浓度为5
‑
50mmol。
[0020]作为进一步技术方案，所述催化剂为吡啶。
[0021]作为进一步技术方案，所述衍生化反应的温度为4
‑
50℃，优选为40℃；
[0022]所述衍生化反应的时间为10
‑
60min，优选为40min。
[0023]作为进一步技术方案，所述甲酸水溶液的浓度为0.01％～0.2％。
[0024]作为进一步技术方案，所述甲酸水溶液的浓度为0.1％。
[0025]作为进一步技术方案，所述高效液相色谱的条件还包括：
[0026]色谱柱柱温为35
‑
55℃，优选为40℃；
[0027]进样量为2～5μL，优选为2μL。
[0028]作为进一步技术方案，所述样品进行衍生化处理前还包括样品的提取步骤。
[0029]作为进一步技术方案，所述提取步骤包括：将样品溶解于溶剂中，固液分离后取清液；
[0030]所述溶剂包括甲醇溶液；
[0031]所述甲醇溶液的浓度为70％～95％，优选为80％。
[0032]作为进一步技术方案，衍生化后的有机酸的质谱参数如下：
[0033]延胡索酸：
[0034]正负模式：Negative，母离子：384.988，子离子：231.97，碰撞能量：17.89eV，射频电压：88V；或者，正负模式：Negative，母离子：384.988，子离子：234.042，碰撞能量：14.69eV，射频电压：88V；
[0035]柠檬酸：
[0036]正负模式：Negative，母离子：596，子离子：222.03，碰撞能量：27.7eV，射频电压：97V；或者，正负模式：Negative，母离子：596，子离子：401.054，碰撞能量：18.1eV，射频电压：97V；
[0037]柠康酸：
[0038]正负模式：Negative，母离子：399.05，子离子：246.071，碰撞能量：17.38eV，射频电压：76V；或者，正负模式：Negative，母离子：399.05，子离子：248.095，碰撞能量：14.73eV，射频电压：76V；
[0039]苹果酸：
[0040]正负模式：Negative，母离子：403.088，子离子：207.97，碰撞能量：17.72eV，射频电压：74V；或者，正负模式：Negative，母离子：403.088，子离子：250.071，碰撞能量：13.47eV，射频电压：74V；
[0041]L乳酸：
[0042]正负模式：Negative，母离子：224，子离子：152.042，碰撞能量：14.77eV，射频电压：50V；或者，正负模式：Negative，母本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种有机酸的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：将待测样品进行衍生化处理和添加内标溶液后，采用高效液相色谱
‑
串联质谱法对样品中的有机酸进行定量分析；所述衍生化处理包括：采用3
‑
硝基苯肼对样品中的有机酸进行衍生化反应；所述内标溶液包括采用C13
‑3‑
硝基苯肼衍生化处理的有机酸；所述有机酸包括：衣康酸、柠康酸、中康酸、L
‑
乳酸、琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸、延胡索酸、乌头酸、酮戊二酸、丙酮酸和草酰乙酸；所述高效液相色谱的条件包括：色谱柱：waters HSS T3 2.1*150mm、Waters BEH C18 2.1*100mm或waters HSS T3 2.1*100mm；流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸水溶液，所述流动相B为乙腈；洗脱程序：0
‑
1min 40％流动相B，1
‑
3.5min流动相B逐渐升至60％，3.5
‑
8.5min流动相B逐渐升至75％，8.5
‑
11.5min流动相B逐渐升至100％，11.5
‑
13.5 100％流动相B，13.5
‑
14min流动相B逐渐降至40％，14
‑
16min 40％流动相B；所述质谱的条件包括：电喷雾电离源，离子源温度300
‑
400℃，离子源电压负/正模式(
‑
2500～
‑
3000V)/(3500～4000V)，鞘气30
‑
40psi，辅助气5
‑
15psi，碰撞气1
‑
2psi，采用多重反应监测进行扫描。2.根据权利要求1所述的有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述衍生化处理为在催化剂和活化剂存在的情况下进行衍生化反应；所述催化剂包括吡啶、4
‑
二甲氨基吡啶或乙酸；所述活化剂包括N
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)
‑
N＇
‑
乙基碳二亚胺；所述衍生化反应的介质包括甲醇水溶液；所述衍生化反应的体系中，3
‑
硝基苯肼或C13
‑3‑
硝基苯肼的浓度为2.5
‑
50mmol，催化剂的体积浓度为0.1％
‑
5％，活化剂的浓度为5
‑
50mmol。3.根据权利要求2所述的有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述催化剂为吡啶。4.根据权利要求2所述的有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述衍生化反应的温度为4
‑
50℃；所述衍生化反应的时间为10
‑
60min。5.根据权利要求1所述的有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述甲酸水溶液的浓度为0.01％～0.2％。6.根据权利要求5所述的有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述甲酸水溶液的浓度为0.1％。7.根据权利要求1所述的有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱的条件还包括：色谱柱柱温为35
‑
55℃；进样量为2～5μL。8.根据权利要求1所述的有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述样品进行衍生化处理前还包括样品的提取步骤。9.根据权利要求8所述的有机酸的定量检测方法，其特征在于，所述提取步骤包括：将样品溶解于溶剂中，固液分离后取清液；
所述溶剂包括甲醇溶液；所述甲醇溶液的浓度为70％～95％。10.根据权利要求1
‑
9任一项所述的有机酸的定量检测方法，其特征在于，衍生化后的有机酸的质谱参数如下：延胡索酸：正负模式：Negative，母离子：384.988，子离子：231.97，碰撞能量：17.89eV，射频电压：88V；或者，正负模式：Negative，母离子：384.988，子离子：234.042，碰撞能量：14.69eV，射频电压：88V；柠檬酸：正负模式：Negative，母离子：596，子离子：222.03，碰撞能量：27.7eV，射频电压：97V；或者，正负模式：Negative，母离子：596，子离子：401.054，碰撞能量：18.1eV，射频电压：97V；柠康酸：正负模式：Negative，母离子：399.05，子离子：246.071，碰撞能量：17.38eV，射频电压：76V；或者，正负模式：Negative，母离子：399.05，子离子：248.095，碰撞能量：14.73eV，射频电压：76V；苹果酸：正负模式：Negative，母离子：403.088，子离子：207.97，碰撞能量：17.72eV，射频电压：74V；或者，正负模式：Negative，母离子：403.088，子离子：250.071，碰撞能量：13.47eV，射频电压：74V；L乳酸：正负模式：Negative，母离子：224，子离子：152.042，碰撞能量：14.77eV，射频电压：50V；或者，正负模式：Negative，母离子：224，子离子：137.042，碰撞能量：18.27eV，射频电压：50V；乌头酸：正负模式：Negative，母离子：577.95，子离子：425.083，碰撞能量：15.45eV，射频电压：101V；或者，正负模式：Negative，母离子：577.95，子离子：178.054，碰撞能量：20.88eV，射频电压：101V；琥珀酸：正负模式：Negative，母离子：387.088，子离子：234.042，碰撞能量：17.59eV，射频电压：85V；或者，正负模式：Negative，母离子：387.088，子离子：98.071，碰撞能量：34.82eV，射频电压：85V；中康酸：正负模式：Negative，母...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷焕娜，赵晓雯，余文祥，赵亚丽，
申请(专利权)人：北京诺禾致源科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：