本发明专利技术公开了兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力的双网络水凝胶用于制备生物组织工程支架的方法。该方法包括：将甲基丙烯酰化明胶(GelMA)与甲基丙烯酸缩水甘油酯丝素蛋白(SilMA)溶液混合，加入少量PEG(20000Da)和光引发剂，通过蓝光引发GelMA，SilMA上的双键发生化学交联，形成力学性能良好的双网络水凝胶，PEG作为制孔剂，为细胞预留了足够的生长空间，提升细胞的增殖能力，通过这种方式可制备生物相容性良好，力学性能良好的可打印三元复合水凝胶。本技术方案可用于体外致密实体肿瘤模型、软骨组织模型、纤维化组织模型的制备，对高力学性能高细胞增殖能力组织工程支架材料的设计与制备具有意义。的设计与制备具有意义。的设计与制备具有意义。
【技术实现步骤摘要】
兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力的双网络水凝胶用于制备生物组织工程支架的方法
[0001]本专利技术属于可降解生物医用材料
，具体涉及到兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力的双网络水凝胶的制备方法和应用。
技术介绍
[0002]水凝胶在组织工程中已被广泛应用，但单一组分水凝胶具有多种明显缺陷，如力学性能差、降解速度过快等；复合水凝胶可以取长补短，将不同材料的优势进行互补，有望改善这些问题。甲基丙烯酰氧基改性的明胶是最常用的组织工程材料，丝素蛋白的添加可明显提升复合水凝胶的力学性能，已被用于力学性能有需求的多种病理模型的制备，如软骨，骨组织等。但此类双网络水凝胶的网络致密，细胞生长空间狭窄，限制了细胞的增殖，具有明显的缺陷。
[0003]生物相容性较好且可降解的壳聚糖、明胶、果胶、海藻酸盐等天然高分子材料所制备的水凝胶在药物载体，伤口辅料，体内组织模型构建上已有较多应用。但力学性能较差，降解周期太短等因素限制了这些水凝胶的在组织工程上的进一步使用。因此，在水凝胶中添加无机材料，纳米粒子等其他材料来改变这些不足显得至关重要。在使用水凝胶材料构建体外病理模型时，复合水凝胶的溶质浓度至关重要，低浓度的GelMA虽然具有较好的生物相容性，但力学性能差，不易成型，且不能达到病理模型所需要的压力环境。过度添加GelMA的含量又会使得水凝胶的孔隙率降低，影响营养物质的传输以及细胞伸展，从而导致细胞生物相容性降低。SilMA具备较好的力学性能，与GelMA结合可以弥补这些问题，适当的添加SilMA之后，在不影响其水凝胶的孔隙率的条件下可增加复合水凝胶的力学性能。而如何进一步提高力学性能的同时提高细胞增殖能力，还需要进一步研究。
技术实现思路
[0004]为了克服现有技术存在的不足，本专利技术提供了一种兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力混合水凝胶及其制备方法与应用。本专利技术通过将双键改性明胶(GelMA)和双键改性丝素蛋白(SilMA)两种材料混合，再将混合液中加入不同含量的PEG(20000Da)(以下简称PEG)，经光引发剂诱导双键链接后形成复合水凝胶。本专利技术通过增加双键改性丝素蛋白(SilMA)的含量增加其力学性能，降低溶胀率。高分子量的PEG的添加使得水凝胶相和PEG相更好的分离，去除PEG后会在水凝胶中形成孔洞，同时且随着PEG的含量的增加，使水凝胶的孔洞连接更为宽松，增加细胞之间的沟通，更好的用于体外模拟病理模型，SilMA的力学性能较高，可提高复合水凝胶的力学性能。
[0005]本专利技术提供的兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力混合水凝胶，能够满足骨/软骨/纤维化组织/癌症模型支架对于孔隙率、降解以及力学性能的需求，且特别适用于骨/软骨/纤维化组织/癌症模型的修复。
[0006]本专利技术的目的至少通过如下技术方案之一实现。
[0007]1.一种甲基丙烯酰化明胶(GelMA)/甲基丙烯酸缩水甘油基改性丝素蛋白(SilMA)加入PEG形成复合水凝胶的制备方法：
[0008]将GelMA与SilMA溶液复合得到混合溶液，加入PEG后，并适当添加LAP光引发剂，利用405nm波长蓝光照射混合水凝胶15s。诱导双键与自由基结合，SilMA产生构象转变，最终获得一种兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力混合水凝胶的GelMA/SilMA/PEG复合水凝胶。
[0009]2.为达上述目的，本专利技术提供了一种兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力混合水凝胶的制备方法，具体步骤：
[0010](1)制备自由基引发剂溶液：将光引发剂LAP溶于PBS中，得到自由基引发剂溶液，避光代用。
[0011](2)称取GelMA和SilMA溶于步骤(1)的自由基引发剂溶液中，再加入PEG，混合均匀得到复合水凝胶混合液；
[0012]步骤(2)所述甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的取代度不低于60％。制备方法参考文献(KimSH,etal.Preciselyprintableandbiocompatiblesilkfibroinbioinkfordigital lightprocessing3Dprinting[J].NatCommun,1918,9(1):1619.)。
[0013]步骤(2)配制GelMA溶液的过程中，25℃下溶解甲基丙烯酰化明胶(GelMA)，在搅拌促进溶解的过程中，搅拌速率为400rpm。
[0014]步骤(2)所述双键改性丝素(SilMA)的取代率不低于40％；所述SilMA的制备方法可参照文献(KimSH,etal.Preciselyprintableandbiocompatiblesilkfibroin bioinkfordigitallightprocessing3Dprinting[J].NatCommun,1918,9(1):1619.)。详细的，步骤(2)所述SilMA的制备经脱胶的丝素蛋白溶解于9.3M饱和溴化锂盐溶液中。在高温水浴和快速搅拌的状态下缓慢添加甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)进行反应。反应结束后将反应产物透析，然后离心取上清液并冻干，得到所述的SilMA固体。
[0015]PEG分子量可选择1000
‑
20000Da之间，分子量越高，分子链的移动越慢，当浸入凝胶浴中时，更容易被包裹在里边，当残留的PEG被溶解掉之后，原本被PEG占据的空间便会形成更大的孔。优选PEG的分子量为20000Da。
[0016]进一步地，步骤(2)所述复合水凝胶中，光引发剂LAP的浓度为0.5％(w/v)，甲基丙烯酰化明胶(GelMA)的浓度为10％(w/v)，双键化改性丝素蛋白(SilMA)的浓度为3％
‑
12％(w/v)，PEG的浓度为0.1％
‑
2.5％(w/v)，溶液为0.01MPBS缓冲盐溶液。本专利技术对PEG加入量的调控，使其对力学性能以及细胞增殖能有促进作用。进一步优选为：复合水凝胶混合液中GelMA浓度为10％(w/v)，SilMA浓度为6％(w/v)，PEG浓度为2％(w/v)。
[0017]进一步地，步骤(2)所述诱导自由基交联的时间不低于15s。
[0018]水凝胶可打印性研究包括以下步骤：
[0019](3)将混合溶液作为生物墨水装载到3D打印机的针筒通道中，利用最佳的3D打印机条件将混合材料打印成支架，并用405nm波长点光源进行固化，使复合水凝胶达到从液体到固体的转变。
[0020](4)将打印好的3D支架用0.01MPBS清洗，并置于37℃摇床中过夜以除去PEG。
[0021]详细的，步骤(3)在常温下使用405nm波长点光源进行固化，固化时间不得低于15s。3D打印机的参数中，打印温度控制在20℃
‑
28℃下，打印压力在0.01MPa
‑
0.25MPa，这个
压力范围的打印条件对细胞损伤较小。
[0022]进一步地，步骤(3)所述生物墨水的打印是基于打印针筒在避光条件下打印的，且打印机的冷却台为4℃，复本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力的双网络水凝胶用于制备生物组织工程支架的方法，其特征在于：将GelMA和SilMA两种材料混合，向混合液中加入不同含量的PEG，经光引发剂诱导双键链接后形成复合水凝胶，采用3D打印机打印成支架，进行光固化后置于缓冲液中除去PEG，得到水凝胶生物组织工程支架。2.根据权利要求1所述兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力的双网络水凝胶用于制备生物组织工程支架的方法，其特征在于，制备步骤为：(1)配制光引发剂溶液：将光引发剂溶于缓冲液中，得到引发剂溶液，避光备用；(2)称取GelMA和SilMA溶于步骤(1)的引发剂溶液中，再加入PEG，混合均匀得到复合水凝胶混合液(3)将复合水凝胶混合液作为生物墨水装载到3D打印机的针筒通道中，利用3D打印机将复合水凝胶打印成支架，进行光固化，得到水凝胶3D支架；(4)将打印好的水凝胶3D支架清洗，并浸泡除去PEG，得到水凝胶生物组织工程支架材料。3.根据权利要求1所述兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力的双网络水凝胶用于制备生物组织工程支架的方法，其特征在于：步骤(1)光引发剂为LAP，缓冲液为0.01MPBS缓冲液。4.根据权利要求1所述兼顾良好力学性能和高细胞增殖能力的双网络水凝胶用于制备生物组织工程支架的方法，其特征在于：复合水凝胶混合液中光引发剂浓度为0.5％(w/v)，GelMA浓度为10％(w/v)，SilMA浓度为3％
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12％(w/v)，PEG浓度为0.1％...
【专利技术属性】
技术研发人员：招秀伯，闫家选，罗瑜，吴静宇，张鹏，尤蓉蓉，王楠，别士月，邱金国，
申请(专利权)人：常州大学，
类型：发明
国别省市：
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