具有降低的蛋白酶敏感性的重组唾液酸酶、唾液酸酶融合蛋白及其使用方法技术

本发明专利技术通常涉及重组唾液酸酶(例如，具有降低的蛋白酶敏感性的重组唾液酸酶)、重组融合蛋白和抗体缀合物，以及它们在治疗癌症中的用途。用途。用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有降低的蛋白酶敏感性的重组唾液酸酶、唾液酸酶融合蛋白及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年7月3日提交的美国临时专利申请系列号63/047,989和2021年1月6日提交的美国临时专利申请系列号63/134,411的利益和优先权，每个所述临时申请的全部公开内容在此通过引用整体并入。


[0003]本专利技术一般涉及重组唾液酸酶(例如，具有降低的蛋白酶敏感性的重组唾液酸酶)和重组融合蛋白以及它们在治疗癌症中的用途。

技术介绍

[0004]越来越多的证据支持聚糖以及特别是唾液酸聚糖在肿瘤进展的各个病理生理步骤中的作用。聚糖调控肿瘤增殖、侵袭、血源性转移和血管生成(Fuster等人，(2005)NAT.REV.CANCER 5(7):526
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42)。在癌症中细胞表面糖缀合物的唾液酸化经常被改变，导致唾液酸化肿瘤相关糖类抗原的表达。肿瘤细胞对唾液酸化聚糖的表达通常与肿瘤的侵袭性和转移潜力提高相关(Julien S.,Delannoy P.(2015)Sialic Acid an本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组突变唾液酸酶酶(例如，人唾液酸酶酶)，其中所述唾液酸酶包含提高对蛋白酶切割的抗性的突变。2.如权利要求1所述的酶，其中所述唾液酸酶与蛋白酶的孵育产生小于50％(例如，小于40％、小于30％、小于10％、小于5％、小于3％、小于1％或小于0.5％)的相应野生型唾液酸酶在与所述蛋白酶在相同条件下孵育时的蛋白水解切割。3.如权利要求1或权利要求2所述的酶，其中所述蛋白酶是胰蛋白酶。4.如权利要求1
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3中任一项所述的酶，其中所述唾液酸酶包含：(a)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的取代；(b)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的取代；(c)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的取代；(d)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的取代；(e)在对应于野生型人类Neu2的第243位的位置处精氨酸残(R243)基的取代；(f)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的取代；(g)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的取代；(h)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的取代；(i)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的取代；或任何上述取代的组合。5.如权利要求4所述的酶，其中，在所述唾液酸酶中：(a)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)取代；(b)在对应于野生型人类Neu2(L240)的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)取代；(c)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基(R241)被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)，或酪氨酸(R241Y)取代；(d)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基(A242)被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、蛋氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；(e)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基(V244)被异亮氨酸(V244I)、赖氨酸(V244K)或脯氨酸(V244P)取代；(f)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处的丝氨酸残基(S258)被半胱氨酸取代(S258C)；(g)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)取代；(h)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)被苯丙氨酸取代(V265F)；或任何上述取代的组合。6.如权利要求5所述的酶，其中，所述唾液酸酶包含如表2中所列的取代的组合。7.一种重组突变人唾液酸酶酶，其中所述唾液酸酶包含：
(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的取代；(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的取代；(c)在对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处丙氨酸残基(A42)的取代；(d)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的取代；(e)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的取代；(f)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的取代；(g)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的取代；(h)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的取代；(i)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的取代；(j)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的取代；(k)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的取代；(l)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的取代；(m)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的取代；(n)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的取代；(o)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的取代；(p)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的取代；(q)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的取代；(r)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的取代；(s)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的取代；(t)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的取代；(u)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的取代；(v)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的取代；(w)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的取代；(x)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的取代；(y)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的取代；(z)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的取代；(aa)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的取代；(bb)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的取代；(cc)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的取代；(dd)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的取代；(ee)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的取代；(ff)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的取代；(gg)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的取代；(hh)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的取代；(ii)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的取代；(jj)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的取代；(kk)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的取代；(ll)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的取代；(mm)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的取代；
(nn)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的取代；(oo)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的取代；或(pp)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的取代；或任何上述取代的组合。8.一种重组突变人唾液酸酶酶，其中所述唾液酸酶包含：(a)在对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处脯氨酸残基(P5)的取代；(b)在对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处赖氨酸残基(K9)的取代；(c)在对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处赖氨酸残基(K44)的取代；(d)在对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处赖氨酸残基(K45)的取代；(e)在对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处亮氨酸残基(L54)的取代；(f)在对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处脯氨酸残基(P62)的取代；(g)在对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处谷氨酰胺残基(Q69)的取代；(h)在对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处精氨酸残基(R78)的取代；(i)在对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处天冬氨酸残基(D80)的取代；(j)在对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处丙氨酸残基(A93)的取代；(k)在对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处甘氨酸残基(G107)的取代；(l)在对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处谷氨酰胺残基(Q108)的取代；(m)在对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处谷氨酰胺残基(Q112)的取代；(n)在对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处半胱氨酸残基(C125)的取代；(o)在对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处谷氨酰胺残基(Q126)的取代；(p)在对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处丙氨酸残基(A150)的取代；(q)在对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处半胱氨酸残基(C164)的取代；(r)在对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处精氨酸残基(R170)的取代；(s)在对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处丙氨酸残基(A171)的取代；(t)在对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处谷氨酰胺残基(Q188)的取代；(u)在对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处精氨酸残基(R189)的取代；(v)在对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处丙氨酸残基(A213)的取代；(w)在对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处亮氨酸残基(L217)的取代；(x)在对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处谷氨酸残基(E225)的取代；(y)在对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处组氨酸残基(H239)的取代；(z)在对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处亮氨酸残基(L240)的取代；(aa)在对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处精氨酸残基(R241)的取代；(bb)在对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处丙氨酸残基(A242)的取代；(cc)在对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处缬氨酸残基(V244)的取代；(dd)在对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处苏氨酸残基(T249)的取代；(ee)在对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处天冬氨酸残基(D251)的取代；(ff)在对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处谷氨酸残基(E257)的取代；(gg)在对应于野生型人类Neu2的第258位的位置处丝氨酸残基(S258)的取代；(hh)在对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处亮氨酸残基(L260)的取代；
(ii)在对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处缬氨酸残基(V265)的取代；(jj)在对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处谷氨酰胺残基(Q270)的取代；(kk)在对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处色氨酸残基(W292)的取代；(ll)在对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处丝氨酸残基(S301)的取代；(mm)在对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处色氨酸残基(W302)的取代；(nn)在对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处缬氨酸残基(V363)的取代；或(oo)在对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处亮氨酸残基(L365)的取代；或任何上述取代的组合。9.如权利要求7或8所述的酶，其中所述唾液酸酶包含K9、A42、P62、A93、Q126、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的取代或任何上述取代的组合。10.如权利要求7或8所述的酶，其中所述唾液酸酶包含K9、P62、A93、Q126、A242、Q270、S301、W302、V363或L365的取代或任何上述取代的组合。11.如权利要求7
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10中任一项所述的酶，其中，在所述唾液酸酶中：(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸取代(P5H)；(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸取代(K9D)；(c)在对应于野生型人类Neu2的第42位的位置处的丙氨酸残基被精氨酸取代(A42R)；(d)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)取代；(e)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)取代；(f)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸取代(L54M)；(g)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)取代；(h)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q69H)；(i)对应于野生型人类Neu2的第78位的位置处的精氨酸残基被赖氨酸取代(R78K)；(j)对应于野生型人类Neu2的第80位的位置处的天冬氨酸残基被脯氨酸取代(D80P)；(k)对应于野生型人类Neu2的第93位的位置处的丙氨酸残基被谷氨酸(A93E)或赖氨酸(A93K)取代；(l)对应于野生型人类Neu2的第107位的位置处的甘氨酸残基被天冬氨酸取代(G107D)；(m)对应于野生型人类Neu2的第108位的位置处的谷氨酰胺残基被组氨酸取代(Q108H)；(n)对应于野生型人类Neu2的第112位的位置处的谷氨酰胺残基被精氨酸(Q112R)或赖氨酸(Q112K)取代；(o)对应于野生型人类Neu2的第125位的位置处的半胱氨酸残基被亮氨酸取代(C125L)；(p)对应于野生型人类Neu2的第126位的位置处的谷氨酰胺残基被亮氨酸(Q126L)、谷氨酸(Q126E)、苯丙氨酸(Q126F)、组氨酸(Q126H)、异亮氨酸(Q126I)或酪氨酸(Q126Y)取代；
(q)对应于野生型人类Neu2的第150位的位置处的丙氨酸残基被缬氨酸取代(A150V)；(r)对应于野生型人类Neu2的第164位的位置处的半胱氨酸残基被甘氨酸取代(C164G)；(s)对应于野生型人类Neu2的第170位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R170P)；(t)对应于野生型人类Neu2的第171位的位置处的丙氨酸残基被甘氨酸取代(A171G)；(u)对应于野生型人类Neu2的第188位的位置处的谷氨酰胺残基被脯氨酸取代(Q188P)；(v)对应于野生型人类Neu2的第189位的位置处的精氨酸残基被脯氨酸取代(R189P)；(w)对应于野生型人类Neu2的第213位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A213C)、天冬酰胺(A213N)、丝氨酸(A213S)或苏氨酸(A213T)取代；(x)对应于野生型人类Neu2的第217位的位置处的亮氨酸残基被丙氨酸(L217A)或缬氨酸(L217V)取代；(y)对应于野生型人类Neu2的第225位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸取代(E225P)；(z)对应于野生型人类Neu2的第239位的位置处的组氨酸残基被脯氨酸取代(H239P)；(aa)对应于野生型人类Neu2的第240位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L240D)、天冬酰胺(L240N)或酪氨酸(L240Y)取代；(bb)对应于野生型人类Neu2的第241位的位置处的精氨酸残基被丙氨酸(R241A)、天冬氨酸(R241D)、亮氨酸(R241L)、谷氨酰胺(R241Q)或酪氨酸(R241Y)取代；(cc)对应于野生型人类Neu2的第242位的位置处的丙氨酸残基被半胱氨酸(A242C)、苯丙氨酸(A242F)、甘氨酸(A242G)、组氨酸(A242H)、异亮氨酸(A242I)、赖氨酸(A242K)、亮氨酸(A242L)、甲硫氨酸(A242M)、天冬酰胺(A242N)、谷氨酰胺(A242Q)、精氨酸(A242R)、丝氨酸(A242S)、缬氨酸(A242V)、色氨酸(A242W)或酪氨酸(A242Y)取代；(dd)对应于野生型人类Neu2的第244位的位置处的缬氨酸残基被异亮氨酸(V244I)或脯氨酸(V244P)取代；(ee)对应于野生型人类Neu2的第249位的位置处的苏氨酸残基被丙氨酸取代(T249A)；(ff)对应于野生型人类Neu2的第251位的位置处的天冬氨酸残基被甘氨酸取代(D251G)；(gg)对应于野生型人类Neu2的第257位的位置处的谷氨酸残基被脯氨酸取代(E257P)；(hh)对应于第258位的位置处的丝氨酸残基被半胱氨酸取代(S258C)；(ii)对应于野生型人类Neu2的第260位的位置处的亮氨酸残基被天冬氨酸(L260D)、苯丙氨酸(L260F)、谷氨酰胺(L260Q)或苏氨酸(L260T)取代；(jj)对应于野生型人类Neu2的第265位的位置处的缬氨酸残基被苯丙氨酸取代(V265F)；(kk)对应于野生型人类Neu2的第270位的位置处的谷氨酰胺残基被丙氨酸(Q270A)、组氨酸(Q270H)、苯丙氨酸(Q270F)、脯氨酸(Q270P)、丝氨酸(Q270S)或苏氨酸(Q270T)取代；(ll)对应于野生型人类Neu2的第292位的位置处的色氨酸残基被精氨酸取代(W292R)；(mm)对应于野生型人类Neu2的第301位的位置处的丝氨酸残基被丙氨酸(S301A)、天冬氨酸(S301D)、谷氨酸(S301E)、苯丙氨酸(S301F)、组氨酸(S301H)、赖氨酸(S301K)、亮氨酸(S301L)、甲硫氨酸(S301M)、天冬酰胺(S301N)、脯氨酸(S301P)、谷氨酰胺(S301Q)、精氨酸
(S301R)、苏氨酸(S301T)、缬氨酸(S301V)、色氨酸(S301W)或酪氨酸(S301Y)取代；(nn)对应于野生型人类Neu2的第302位的位置处的色氨酸残基被丙氨酸(W302A)、天冬氨酸(W302D)、苯丙氨酸(W302F)、甘氨酸(W302G)、组氨酸(W302H)、异亮氨酸(W302I)、赖氨酸(W302K)、亮氨酸(W302L)、甲硫氨酸(W302M)、天冬酰胺(W302N)、脯氨酸(W302P)、谷氨酰胺(W302Q)、精氨酸(W302R)、丝氨酸(W302S)、苏氨酸(W302T)、缬氨酸(W302V)或酪氨酸(W302Y)取代；(oo)对应于野生型人类Neu2的第363位的位置处的缬氨酸残基被精氨酸取代(V363R)；或(pp)对应于野生型人类Neu2的第365位的位置处的亮氨酸残基被谷氨酰胺(L365Q)、组氨酸(L365H)、异亮氨酸(L365I)、赖氨酸(L365K)或丝氨酸(L365S)取代；或所述唾液酸酶包含任何上述取代的组合。12.如权利要求7
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10中任一项所述的酶，其中在所述唾液酸酶中：(a)对应于野生型人类Neu2的第5位的位置处的脯氨酸残基被组氨酸取代(P5H)；(b)对应于野生型人类Neu2的第9位的位置处的赖氨酸残基被天冬氨酸取代(K9D)；(c)对应于野生型人类Neu2的第44位的位置处的赖氨酸残基被精氨酸(K44R)或谷氨酸(K44E)取代；(d)对应于野生型人类Neu2的第45位的位置处的赖氨酸残基被丙氨酸(K45A)、精氨酸(K45R)或谷氨酸(K45E)取代；(e)对应于野生型人类Neu2的第54位的位置处的亮氨酸残基被甲硫氨酸取代(L54M)；(f)对应于野生型人类Neu2的第62位的位置处的脯氨酸残基被天冬酰胺(P62N)、天冬氨酸(P62D)、组氨酸(P62H)、谷氨酸(P62E)、甘氨酸(P62G)、丝氨酸(P62S)或苏氨酸(P62T)取代；(g)对应于野生型人类Neu2的第69位的位置处的谷氨酰胺残基被组...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭力，桑迪普，
申请(专利权)人：帕利昂制药有限公司，
类型：发明
国别省市：