一种采用UPLC-PDA同时检测清瘟败毒散中6味药的方法技术

本发明专利技术涉及一种采用UPLC

【技术实现步骤摘要】
一种采用UPLC
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PDA同时检测清瘟败毒散中6味药的方法


[0001]本专利技术涉及一种采用UPLC
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PDA同时检测清瘟败毒散中6味药的方法，属于兽药中有效成分检测领域。

技术介绍

[0002]清瘟败毒散为中兽药成方制剂，收载于《中华人民共和国兽药典(2020年版)》二部p755，本药由石膏、地黄、水牛角、黄连等14味药材组成。清瘟败毒散的处方包括:生石膏120g、生地黄30g、水牛角60g、黄连20g、栀子30g、牡丹皮20g、黄芩25g、赤芍25g、玄参25g、知母30g、连翘30g、桔梗25g、甘草15g、淡竹叶25g；为黄黄色的粉末；味苦、微甘，具有泻火解毒，凉血的功效，主治热度发斑，高热神昏。广泛应用于集约化畜禽养殖企业。
[0003]清瘟败毒散的质量标准仅有显微鉴别和黄连、盐酸小檗碱的薄层鉴别，显微鉴别如下：
[0004]1、石膏：不规则片状结晶无色，有平直纹理；2、地黄：薄壁组织灰棕色至黑棕色，细胞多皱缩，内含棕色核状物；3、水牛角：不规则碎片多呈柴片状，稍有光泽，具有规则纵长裂缝；4、黄连：纤维束鲜黄色，壁稍厚，纹孔明显；5、栀子：种皮石细胞黄色或淡棕色，多破碎，完整者长多角形、长方形或形状不规则，壁厚有大的圆形纹孔，胞腔棕红色；6、赤芍、牡丹皮：草酸钙簇晶存在于无色薄壁细胞中，有时数个排列成行；7、黄芩：纤维淡黄色，梭形，壁厚，孔沟细；8、玄参：石细胞黄棕色或无色，类长方形、类圆形或形状不规则，直径约至94μm；9、知母：草酸钙针晶成束或散在，长26～110μm；10、连翘：内果皮纤维上下层纵横交错，纤维短梭形；11、甘草：纤维束周围薄壁细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维；12、淡竹叶：表皮细胞狭长，垂周壁深波状弯曲，有气孔，保卫细胞哑铃状。
[0005]薄层鉴别项(黄连、盐酸小檗碱)，《中国兽药典(2020年版)》二部收载的方法中，薄层鉴别方法如下：
[0006]取本品1g，加甲醇5ml，加热回流15分钟，滤过，滤液补加甲醇使成5ml，作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.1g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯－乙酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液(12：6：3：3：1)为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
[0007]但是采用薄层色谱，斑点受环境温湿度和人为操作的影响非常大，斑点常常不清晰，结果不易判定，而且费时，费试剂，在实际检验工作中发现层析用的展开剂毒性大，例如：苯、乙酸乙酯，异丙醇，甲醇，浓氨等多种试剂，对实验人员的伤害比较大。而且操作繁琐，用时较多，无法同时检测多种有效成分。
[0008]另外薄层色谱前期准备复杂，需要预饱和，展开，晾干，检视查看结果等多个步骤，费时费力，而且受环境温湿度等因素的干扰比较大，边缘效应等，薄层斑点有时方法难以判
别，重现性差。

技术实现思路

[0009]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种采用UPLC
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PDA同时检测清瘟败毒散中6味药的方法。
[0010]该方法能同时测定清瘟败毒散中甘草苷，甘草酸，盐酸小檗碱，黄芩苷，黄芩素，连翘苷，栀子苷，盐酸药根碱，芍药苷9种成分的含量，从而同时检测黄连、栀子、黄芩、赤芍、连翘和甘草6味药，该方法通过光谱和色谱来定性定量测定，快速、灵敏、准确、专属性强，通过一次样品处理，即可同时测定9种成分的含量，不仅节省了试剂、时间，还提高了工作效率。
[0011]为实现以上目的，本专利技术是通过如下技术方案实现的：
[0012]一种采用UPLC
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PDA同时检测清瘟败毒散中6味药的方法，用于同时测定清瘟败毒散中甘草苷，甘草酸，盐酸小檗碱，黄芩苷，黄芩素，连翘苷，栀子苷，盐酸药根碱，芍药苷9种成分的含量，从而同时检测黄连、栀子、黄芩、赤芍、连翘和甘草6味药，采用UPLC
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PDA方法进行定性定量测定，以Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱为优选色谱柱，乙腈
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0.4％磷酸水溶液进行梯度洗脱，同时利用检测波长232nm、238nm和251nm进行检测，具体洗脱程序为：
[0013][0014][0015]具体测定步骤如下：
[0016]a、制备对照储备液和混合对照储备溶液
[0017]取甘草苷、甘草酸、盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、连翘苷、栀子苷、盐酸药根碱、芍药苷对照品，加25
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75％乙醇溶解，分别配制成对照储备液，将各对照储备液混合，得到混合对照储备溶液；
[0018]b、制备待测样品溶液：取供试品，置于容量瓶中，用25
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75％乙醇溶解，超声提取、离心、过滤，得待测样品溶液；
[0019]c、将混合对照储备溶液注入UPLC
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PDA色谱仪，在如下色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据进样量所测峰面积的大小与其进样量的对应关系绘制标准曲线；
[0020]d、定性定量测定：取步骤b中滤液注入UPLC
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PDA色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据步骤d中制作的标准曲线定量，计算出供试品中有效成分的含量。
[0021]根据本专利技术优选的，步骤a中，甘草苷对照储备液的浓度为150
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180μg/mL，甘草酸对照储备液的浓度为180
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200μg/mL，盐酸小檗碱对照储备液的浓度为250
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270μg/mL，黄芩苷对照储备液的浓度为225
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245μg/mL，黄芩素对照储备液的浓度为145
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165μg/mL，连翘苷对照储备液的浓度为40
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60μg/mL，栀子苷对照储备液的浓度为265
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285μg/mL，盐酸药根碱对照储备液的浓度为185
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205μg/mL，芍药苷对照储备液的浓度为210
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230μg/mL。
[0022]根据本专利技术优选的，步骤a中，混合对照储备溶液中甘草苷的浓度为10
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20μg/mL，甘草酸的浓度为30
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40μg/mL，盐酸小檗碱的浓度为20
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30μg/mL，黄芩苷的浓度为40
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50μg/mL，黄芩素的浓度为10
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20μg/mL，连翘苷的浓度为3
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8μg/mL，栀子苷的浓度为20
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30μg/mL，盐酸药根碱的浓度为12
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种采用UPLC
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PDA同时检测清瘟败毒散中6味药的方法，用于同时测定清瘟败毒散中甘草苷，甘草酸，盐酸小檗碱，黄芩苷，黄芩素，连翘苷，栀子苷，盐酸药根碱，芍药苷9种成分的含量，从而同时检测黄连、栀子、黄芩、赤芍、连翘和甘草6味药，采用UPLC
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PDA方法进行定性定量测定，以Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱为优选色谱柱，乙腈
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0.4％磷酸水溶液进行梯度洗脱，同时利用检测波长232nm、238nm和251nm进行检测，具体洗脱程序为：时间A项乙腈B项0.4％磷酸曲线1初始595622.0595632.51092645.51092656.512886691288671015856810.515856913.5188261019188261122257561224.5326861326326861327.5703061428.5703061529.5595616325956具体测定步骤如下：a、制备对照储备液和混合对照储备溶液取甘草苷、甘草酸、盐酸小檗碱、黄芩苷、黄芩素、连翘苷、栀子苷、盐酸药根碱、芍药苷对照品，加25
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75％乙醇溶解，分别配制成对照储备液，将各对照储备液混合，得到混合对照储备溶液；b、制备待测样品溶液：取供试品，置于容量瓶中，用25
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75％乙醇溶解，超声提取、离心、过滤，得待测样品溶液；c、将混合对照储备溶液注入UPLC
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PDA色谱仪，在如下色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据进样量所测峰面积的大小与其进样量的对应关系绘制标准曲线；d、定性定量测定：取步骤b中滤液注入UPLC
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PDA色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据步骤d中制作的标准曲线定量，计算出供试品中有效成分的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中，甘草苷对照储备液的浓度为150
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180μg/mL，甘草酸对照储备液的浓度为180
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200μg/mL，盐酸小檗碱对照储备液的浓度为250
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270μg/mL，黄芩苷对照储备液的浓度为225
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245μg/mL，黄芩素对照储备液的浓度为145
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165μg/mL，连翘苷对...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏秀丽，张志民，刘华阳，胡宇莉，汤文利，冯涛，杨志昆，张琦，张含侠，
申请(专利权)人：山东省饲料兽药质量检验中心，
类型：发明
国别省市：