同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法，包括以下步骤：步骤一、将血液样本分成A、B两部分样本，A样本经处理得到样本总睾酮溶液；步骤二、B样本经平衡透析、衍生化反应得到样本游离睾酮溶液；步骤三、用复溶溶液复溶样本总睾酮溶液和样本游离睾酮溶液并混合，得到样本总溶液；步骤四、用LC

【技术实现步骤摘要】
同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法及试剂盒


[0001]本专利技术涉及激素检测
更具体地说，本专利技术涉及一种同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]血液中的睾酮存在游离睾酮和总睾酮两种形式，其中，血液中大约98％的睾酮与蛋白结合形成总睾酮，仅约2％是以游离睾酮形式存在。总睾酮水平与特发性男性性早熟、家族性男性性早熟、肾上腺皮质增生、肾上腺皮质肿瘤、男性睾丸发育不全、无睾征、下丘脑或者垂体性的性腺功能减低等疾病息息相关，而游离睾酮是有活性的状态，测定人体内游离睾酮水平可反映人体生物活性睾酮水平的高低。研究表明，游离睾酮的检测更适合用于研究女性的性腺功能障碍、高雄激素、男性的性发育和青春期障碍、多囊卵巢综合征等。因此，游离睾酮的测量对于男性生育和女性疾病诊断都有非常重要的意义。
[0003]目前，临床常用免疫法和液相色谱串联质谱法(LC
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MS/MS)检测总睾酮浓度，而游离睾酮的检测则是通过计算得到，即分别测总睾酮浓度和性激素结合蛋白浓度，然后通过计算得到游离睾酮浓度，然而由于性激素蛋白或白蛋白除了与睾酮结合，还会与皮质醇等其他类固醇激素结合，因此，利用计算得到的游离睾酮浓度难以反映真实的游离睾酮值。随着现代技术的发展，通过超滤或平衡透析的前处理手段结合LC
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MS/MS可用来检测血液中的游离睾酮，且正在逐渐被临床检测使用，但这种技术仅能用于测定游离睾酮的含量，而不能测定总睾酮的含量。
[0004]鉴于总睾酮和游离睾酮在人体内的重要地位，对其准确定量有助于辅助诊断相关疾病。然而，单一的游离睾酮检测已经具有很大的挑战，同时进行睾酮和游离睾酮的检测将更有挑战性。因此，如何设计检测方法，以获得同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的有益效果是值得深思的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0006]为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法，包括以下步骤：
[0007]步骤一、将血液样本分成A、B两部分样本，在A样本中加入萃取液经振荡、离心、取上层清液、浓缩上层清液得到样本总睾酮溶液，其中，所述萃取液中含有睾酮的同位素内标物；
[0008]步骤二、B样本经平衡透析得到游离睾酮透析液，在所述游离睾酮透析液中加入睾酮的同位素内标物，然后在加热条件下进行衍生化反应，在衍生化反应结束后的游离睾酮透析液中加入萃取液经液液萃取、离心、取上层清液并浓缩，得到样本游离睾酮溶液；
[0009]步骤三、加入复溶溶液复溶步骤一中的所述样本总睾酮溶液和步骤二中的所述样本游离睾酮溶液并混合均匀，得到样本总溶液；
[0010]步骤四、用睾酮标准品分别配制多种标曲浓度梯度的总睾酮标曲溶液和游离睾酮标曲溶液，并加入睾酮的同位素内标物，用LC
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MS/MS技术测定每个标曲浓度下对应的睾酮及其内标峰面积，以标曲浓度、睾酮及其内标峰面积比进行线性回归，得到总睾酮标准曲线和游离睾酮标准曲线，通过LC
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MS/MS同时检测得到所述样本总溶液中的总睾酮及其内标峰面积比、游离睾酮及其内标峰面积比，并代入所述标准曲线计算得到所述样本总溶液中的总睾酮和游离睾酮的含量，其中，配制游离睾酮标曲溶液时睾酮标准品的处理方法与步骤二中所述游离睾酮透析液的处理方法相同。
[0011]优选的是，其特征在于，步骤二中的所述平衡透析操作的温度为37℃，平衡透析时间为4～16h，所述平衡透析操作采用的缓冲液为pH＝7.4的HEPES缓冲液。
[0012]优选的是，其特征在于，步骤二中所述衍生化反应的温度为60～80℃，所述衍生化反应的时间为40～70min，所述衍生化反应采用的衍生化试剂为盐酸羟胺的甲醇水溶液、甲氧基胺的甲醇水溶液中的任意一种，所述衍生化试剂的浓度为0.02～0.06mol/L，所述甲醇水溶液中的甲醇质量分数为20％～80％。
[0013]优选的是，其特征在于，步骤一和步骤二中的所述浓缩操作采用氮气吹干、真空离心干燥浓缩方式中的任意一种。
[0014]优选的是，其特征在于，步骤二中所述液液萃取操作中采用甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚中任意一种，或多种组合形成的混合液为萃取液。
[0015]优选的是，其特征在于，步骤二中的所述复溶溶液为甲醇、乙腈中的任意一种。
[0016]优选的是，其特征在于，步骤二中的所述平衡透析采用的是96孔平衡透析板。
[0017]优选的是，其特征在于，所述LC
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MS/MS采用色谱条件为：流动相Ⅰ为甲酸的水溶液，流动相Ⅱ为甲酸的甲醇溶液，进行梯度洗脱，其中，流动相Ⅰ和流动相Ⅱ形成了液相洗脱试剂。
[0018]优选的是，其特征在于，所述样本包含人血液样本、质控样本和睾酮标准品，其中，所述质控样本采用三个质控浓度，分别为由混合成年男性血液样本制备得到的高浓度质控样本、由成年男性与成年女性血液样本按照一定比例混合制备得到的中浓度质控样本及由混合成年女性血液样本制备得到的低浓度质控样本。
[0019]提供一种基于所述的测定方法的试剂盒，包含标准曲线工作液，质控样本、内标工作液、缓冲液、衍生化试剂和液相洗脱试剂，其中，所述标准曲线工作液由所述睾酮标准品用所述缓冲液配制得到，所述内标工作液由所述睾酮的同位素内标物用所述缓冲液配置得到。
[0020]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0021]第一、本专利技术提供的测定方法可以通过将样品总溶液单次进样用LC
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MS/MS技术即可同时测定血液中总睾酮和游离睾酮的含量，而减少使用LC
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MS/MS三重串联液质联用仪的检测次数以及测定所需的时间，具有较高的临床应用价值。
[0022]第二、本专利技术提供的测定方法将游离睾酮检测灵敏度显著提升至0.5pg/ml，满足女性游离睾酮含量检测的临床需求。
[0023]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0024]图1为本专利技术的其中一种技术方案的所述测定方法的流程图；
[0025]图2为本专利技术的其中一种技术方案的血液中总睾酮和游离睾酮的总离子流图；
[0026]图3为本专利技术的其中一种技术方案的血液中总睾酮的提取离子流图；
[0027]图4为本专利技术的其中一种技术方案的血液中游离睾酮的提取离子流图；
[0028]图5为本专利技术的其中一种技术方案的血液中总睾酮的标准曲线；
[0029]图6为本专利技术的其中一种技术方案的血液中游离睾酮的标准曲线；
[0030]图7为本专利技术的其中一种技术方案的血液中游离睾酮的检测限图；
[0031]图8为本专利技术的其中一种技术方案的血液中总睾酮的检测限图；
[0032]图9为本专利技术的其中一种技术方案的衍生化的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将血液样本分成A、B两部分样本，在A样本中加入萃取液经振荡、离心、取上层清液、浓缩上层清液得到样本总睾酮溶液，其中，所述萃取液中含有睾酮的同位素内标物；步骤二、B样本经平衡透析得到游离睾酮透析液，在所述游离睾酮透析液中加入睾酮的同位素内标物，然后在加热条件下进行衍生化反应，在衍生化反应结束后的游离睾酮透析液中加入萃取液经液液萃取、离心、取上层清液并浓缩，得到样本游离睾酮溶液；步骤三、加入复溶溶液复溶步骤一中的所述样本总睾酮溶液和步骤二中的所述样本游离睾酮溶液并混合均匀，得到样本总溶液；步骤四、用睾酮标准品分别配制多种标曲浓度梯度的总睾酮标曲溶液和游离睾酮标曲溶液，并加入睾酮的同位素内标物，用LC
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MS/MS技术测定每个标曲浓度下对应的睾酮及其内标峰面积，以标曲浓度、睾酮及其内标峰面积比进行线性回归，得到总睾酮标准曲线和游离睾酮标准曲线，通过LC
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MS/MS同时检测得到所述样本总溶液中的总睾酮及其内标峰面积比、游离睾酮及其内标峰面积比，并代入所述标准曲线计算得到所述样本总溶液中的总睾酮和游离睾酮的含量，其中，配制游离睾酮标曲溶液时睾酮标准品的处理方法与步骤二中所述游离睾酮透析液的处理方法相同。2.如权利要求1所述的同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法，其特征在于，步骤二中的所述平衡透析操作的温度为37℃，平衡透析时间为4～16h，所述平衡透析操作采用的缓冲液为pH＝7.4的HEPES缓冲液。3.如权利要求1所述的同时测定血液中总睾酮和游离睾酮含量的方法，其特征在于，步骤二中所述衍生化反应的温度为60～80℃，所述衍生化反应的时间为40～70min，所述衍生化反应采用的衍生化试剂为盐酸羟胺的甲醇水溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：李卫峰，刘文兰，黄荣梅，罗卡，许蕴，吴亦可，徐勇，
申请(专利权)人：深圳市第二人民医院深圳市转化医学研究院，
类型：发明
国别省市：