一种在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法技术

本发明专利技术公开了一种在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法，该方法通过将gRNA阵列池或其转录产物、含有mCherry

【技术实现步骤摘要】
一种在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法。

技术介绍

[0002]遗传密码子是有简并性的，除了用于翻译终信号的3个三联体密码子外，将61个三联体密码子分配给20个天然氨基酸，且20个氨基酸中有18个由多个同义密码子编码。重编码是基因组工程的一个很有前途的应用，它包括用同义密码子替换基因组中所有特定密码子，并敲除相应的转移RNA(tRNA)，从而使被重编码的细胞具有与以前相同的蛋白质组，但使用一个简化的遗传密码。重编码可以赋予细胞病毒抗性，也可用于赋予“空白”密码子新的功能，包括非标准氨基酸整合和生物防护。
[0003]Church实验室首次实现了全基因组重编码，将大肠杆菌中314个UAG终止密码子替换为UAA。然后在大肠杆菌中测试了所有UAG到UAA的替换和释放因子1(允许终止UAG和UAA的翻译)缺失，降低了感染大肠杆菌的4种病毒(λ、M13、P1、MS2)的病毒侵染力。在另一项研究中，一组核糖体基因上的13个有义密码子被改写，两种罕见的精氨酸密码子的123个实例被同义替换。最近，Church实验室通过合成和组装一个3.97百万碱基，57个密码子的大肠杆菌基因组，Jason Chin实验室的同事们已经完成了对61密码子大肠杆菌菌株的完整重编码和组装，并删除了tRNAs和释放因子1，结果细胞完全对病毒的鸡尾酒具有抗性，并将这些密码子用于SYN61中含有三种不同非标准氨基酸的蛋白质的高效合成。但如何在哺乳动物细胞，尤其是人类基因组上实现重编程并没有报道。
[0004]CRISPR
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Cas技术的专利技术，增强了人们对基因组的改造能力，通过设计导向RNA(gRNAs)可进行特定基因的编辑或转录调控。随后基于CRISPR
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Cas衍生出了更为精确的工具，如碱基编辑器、引导编辑器、转座子和整合子等。尽管CRISPR
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Cas及其衍生工具有着较好的普适性，但单个gRNA的使用，限制了其效率和生物技术的应用。因此，现在越来越多的研究开始使用多位点编辑或转录调控的多重复合策略。多重复合CRISPR技术，是指许多gRNAs或Cas酶被表达，大大提高基因编辑和转录调控的范围和效率，促进生物工程应用。目前，在单细胞中表达多个gRNA的方法主要有两种：一种是用单个RNA聚合酶启动子转录每个gRNA表达盒，然后通过Golden gate assembly将多个gRNA表达盒克隆到单个质粒中。另一种方法是使用一个启动子将所有的gRNAs转录到一个转录本中，然后通过不同的策略进行处理以释放单个的gRNAs，这些策略要求每个gRNA的两侧都有可切割的RNA序列，例如自切割核酶序列(例如锤头状核酶和HDV核酶)、外源性切割因子识别序列(例如Cys4)和内源性RNA处理序列(例如tRNA序列和内含子)。
[0005]在单个细胞内实现单个TAG到TAA的转换，可通过将靶向其sgRNA和CBE转染到细胞，但如果需要在单个细胞内同时实现数十个或者数百个TAG到TAA的转换，则需要一次递送尽可能多的相应sgRNAs和CBE，目前还没现成的工具，供使用。
[0006]因此，开发一种在单个细胞中实现高通量的TAG到TAA转换的技术，具有重要意义。

技术实现思路

[0007]为了解决现有技术中的技术问题，本专利技术的目的是提出一种在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法。具体方案如下：
[0008]本专利技术第一方面提供一种gRNA阵列，所述gRNA阵列包含依次串联的5个sgRNA表达盒，每个所述sgRNA表达盒在5
’
至3
’
方向依次包含启动子、sgRNA和polyT，所述sgRNA表达盒中sgRNA选自SEQ ID NO.1～150中的任一序列，所述gRNA阵列的sgRNA各不相同；
[0009]优选地，所述依次串联的5个sgRNA表达盒通过化学方法合成。
[0010]本专利技术第二方面提供一种gRNA阵列池，所述gRNA阵列池包含2～10个gRNA阵列，每个所述gRNA阵列包含依次串联的5个sgRNA表达盒，每个所述sgRNA表达盒在5
’
至3
’
方向依次包含启动子、sgRNA和polyT，所述sgRNA表达盒中sgRNA选自SEQ ID NO.1～150中的任一序列，所述gRNA阵列池的sgRNA各不相同；
[0011]优选地，所述gRNA阵列池包含10个gRNA阵列；
[0012]优选地，所述依次串联的5个sgRNA表达盒通过化学方法合成。
[0013]本专利技术第三方面提供一种表达载体，具有SEQ ID NO.151所示的核苷酸序列。
[0014]本专利技术第四方面提供一种包含所述表达载体的细菌。
[0015]本专利技术第五方面提供一种碱基编辑系统，包括所述的gRNA阵列池或其转录产物，或者，所述的表达载体或其转录产物；
[0016]优选地，所述碱基编辑系统还包含碱基编辑器；所述碱基编辑器选自腺嘌呤碱基编辑器或胞嘧啶碱基编辑器；
[0017]优选地，所述碱基编辑器为胞嘧啶碱基编辑器。
[0018]本专利技术第六方面提供一种多碱基编辑的试剂盒，所述试剂盒包含所述的碱基编辑系统；
[0019]优选地，所述试剂盒还包括含有mCherry
‑
失活eGFP报告分子的质粒和编辑激活eGFP的sgRNA质粒。
[0020]本专利技术第七方面提供一种在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法，包括如下步骤：
[0021]将gRNA阵列通过如下方法转染到细胞中，实现TAG到TAA转换；
[0022]I：所述gRNA阵列池或其转录产物、含有mCherry
‑
失活eGFP报告分子的质粒、编辑激活eGFP的sgRNA质粒与碱基编辑器共转染到细胞；
[0023]II：所述表达载体或其转录产物与碱基编辑器共转染到细胞；
[0024]优选地，所述在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法，还包括分离培养转染后细胞的单克隆，进行Sanger测序和EditR分析，选择高编辑效率的单克隆，通过方法I或II进行gRNA阵列的转染，优选为方法I；
[0025]优选地，所述细胞为哺乳动物细胞；优选地，所述哺乳动物细胞为人哺乳动物细胞。
[0026]本专利技术第八方面提供一种在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法，包括如下步骤：
[0027]将gRNA阵列通过如下方法转染到细胞中，实现TAG到TAA转换；
[0028]I：所述gRNA阵列池或其转录产物、含有mCherry
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失活eGFP报告分子的质粒与编辑
激活eGFP的sgRNA质粒共转染到诱导型碱基编辑器稳定的细胞；
[0029]II：所述表达载体或其转录产物转染到诱导型碱基编辑器稳定的细胞；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种gRNA阵列，其特征在于，所述gRNA阵列包含依次串联的5个sgRNA表达盒，每个所述sgRNA表达盒在5
’
至3
’
方向依次包含启动子、sgRNA和polyT，所述sgRNA表达盒中sgRNA选自SEQ ID NO.1～150中的任一序列，所述gRNA阵列的sgRNA各不相同；优选地，所述依次串联的5个sgRNA表达盒通过化学方法合成。2.一种gRNA阵列池，其特征在于，所述gRNA阵列池包含2～10个gRNA阵列，每个所述gRNA阵列包含依次串联的5个sgRNA表达盒，每个所述sgRNA表达盒在5
’
至3
’
方向依次包含启动子、sgRNA和polyT，所述sgRNA表达盒中sgRNA选自SEQ ID NO.1～150中的任一序列，所述gRNA阵列池的sgRNA各不相同；优选地，所述gRNA阵列池包含10个gRNA阵列；优选地，所述依次串联的5个sgRNA表达盒通过化学方法合成。3.一种表达载体，其特征在于，具有SEQ ID NO.151所示的核苷酸序列。4.一种包含权利要求3所述表达载体的细菌。5.一种碱基编辑系统，其特征在于，包括权利要求2所述的gRNA阵列池或其转录产物，或者，权利要求3所述的表达载体或其转录产物；优选地，所述碱基编辑系统还包含碱基编辑器；所述碱基编辑器选自腺嘌呤碱基编辑器或胞嘧啶碱基编辑器；优选地，所述碱基编辑器为胞嘧啶碱基编辑器。6.一种多碱基编辑的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求5所述的碱基编辑系统；优选地，所述试剂盒还包括含有mCherry
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失活eGFP报告分子的质粒和编辑激活eGFP的sgRNA质粒。7.一种在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法，其特征在于，包括如下步骤：将gRNA阵列通过如下方法转染到细胞中，实现TAG到TAA转换；I：权利要求2所述gRNA阵列池或其转录产物、含有mCherry
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失活eGFP报告分子的质粒、编辑激活eGFP的sgRNA质粒与碱基编辑器共转染到细胞；II：权利要求3所述表达载体或其转录产物与碱基编辑器共转染到细胞；优选地，所述在基因组上高通量实现TAG到TAA转换的方法，还包括分离培养转染后细胞的单克隆，进行Sanger测序和EditR分析，选择高编辑效率的单克隆，通过方法I或II进行gRNA阵列的转染；优...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宇庭，
申请(专利权)人：中国科学院深圳理工大学筹，
类型：发明
国别省市：