本申请公开了一种荧光化合物及其制备方法和作为荧光探针的应用。所述荧光化合物在与具备完整三维结构的蛋白质共存时仅发出微弱荧光；当蛋白质错误折叠、变性及聚集时，荧光化合物与非共价键与各种形态蛋白质选择性高效结合，结合之后发出强烈荧光；且与不同种类蛋白质错误折叠过程中不同状态结合时能产生不同的荧光信号，并以此实现蛋白错误折叠过程中极性和粘度的变化。可在胞内复杂生物环境下特异性的结合蛋白质组，用于荧光方法探测活细胞内或体外的蛋白质错误折叠过程中的极性和粘度变化或定量探测蛋白质内部极性。度变化或定量探测蛋白质内部极性。
【技术实现步骤摘要】
一种荧光化合物及其制备方法和作为荧光探针的应用
[0001]本申请涉及一种荧光化合物及其制备方法和作为荧光探针的应用，属于荧光检测领域。
技术介绍
[0002]致病蛋白质分子的错误折叠、变性与聚集会导致多种人类疾病，包括阿尔兹海默症(Aβ肽段)、疯牛病(朊病毒蛋白)、亨丁顿舞蹈症(polyQ蛋白)、渐冻人症(TDP43和SOD1蛋白等)、糖尿病(IAPP肽段)、帕金森症(α
‑
突触核蛋白)以及淀粉样化病变(轻链蛋白等)。尽管研究人员在蛋白质构型疾病领域耕耘数十年，大部分此类疾病的发病机理仍不十分清晰，致使早期诊断方法和特效治疗手段相对匮乏。其中一个重要原因是，领域内缺乏精准的实验工具在活体细胞中实时实地跟踪观测致病蛋白质的整个错误折叠进程，进而无法确定致病机理。
[0003]由于其高的灵敏度(低的工作浓度)和极低的检测下限，荧光染料分子常被用于探测和解析诸如蛋白质分子的构型变化在内的生化过程，尤其对于蛋白质淀粉样化病变(Amyloidosis)的临床诊断。与具有完整三维结构的正确折叠蛋白质相比，错误折叠的蛋白质中拥有更高比例的β
‑
层状片段，以及由此引起的更疏水、不易水溶、难以降解的致密结构。此外，蛋白质错误折叠过程常伴随分子内部疏水氨基酸侧链的外翻和蛋白质分子间的堆积聚集。这一系列的物理参数的变动会引起局部环境的极性和流动性下降。荧光分子对这种微环境的细微变化十分敏感，常发生荧光量子产率、荧光寿命、荧光偏振和荧光光谱等性质的剧烈改变，常被科学家利用实现探测和识别目的。蛋白体系流动性降低及可视沉淀的生成往往出现在蛋白质错误折叠的末期，在这两者发生显著改变之前对于蛋白质错误折叠的探测无疑对相关疾病的早期诊断及治疗无疑具有重大意义。
[0004]在活细胞原位定量描述蛋白质错误折叠的荧光分子，领域内报道甚少。目前大多数荧光分子要实现活细胞内的检测需要破坏细胞膜的完整性，或是缺乏对聚集蛋白识别的特异性和选择性，不能特异性地与某种蛋白相结合，后者虽然解决了细胞穿透性的问题，但同时也因共价修饰扰动了细胞内蛋白质组原有的生理活性及功能。
[0005]因此，发展能够定量探测蛋白质极性的荧光探针及其相关检测方法，对研究蛋白质错误折叠的生理学过程和蛋白质聚集所导致的疾病有着重大的科学意义和临床价值。
[0006]此外，识别蛋白质错误折叠与聚集的荧光分子和相关检测方法也常用于建立药物筛选方法，如热位移测定法(thermal shift assay)。因此，发展探测蛋白质聚集过程的方法具有广阔的应用前景。
技术实现思路
[0007]本申请要解决的技术问题为利用荧光分子的环境敏感性和结构特异性，实现活细胞内对不同聚集态蛋白质有选择性的识别并根据蛋白质极性差异产生不同荧光信号。在胞内蛋白质的三维结构正常时仅发出微弱荧光，当蛋白质发生错误折叠、微环境极性降低时
荧光波长发生蓝移，进一步变性至聚集时发出强烈荧光。且该类荧光激活类型探针无须对胞内蛋白质组进行广谱共价修饰，故而大幅降低对细胞正常生理功能的干扰和毒性。因此，该专利技术所述荧光探针可用于活细胞内非共价键探测聚集态的蛋白质分子以及蛋白质错误折叠早期的探测及研究。
[0008]为解决上述技术问题，本申请提供的了一种荧光化合物，具有式I的结构：
[0009][0010]其中，R1选自酮基或二氰基；
[0011]n选自0～10；
[0012]R2选自C1～C5烷氧基、久洛尼定基团、氨基或取代的氨基中的一种；所述取代的氨基选自二甲氨基、N,N
‑
二(2
‑
羟乙基)、N
‑
甲基
‑
N
‑
丁酸中的一种；n为1时，R2不为二甲氨基。
[0013]所述取代的氨基为N
‑
甲基
‑
N
‑
丁酸时，N
‑
甲基
‑
N
‑
丁酸的羧基端接枝有基团A；所述基团A为C3‑
20
‑
NH
‑
；所述C3‑
20
中具有一个或两个醚键；所述C3‑
20
中含有烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基或苯环中的至少一种；C3‑
20
的至少一端为基团X；所述基团X选自卤素原子或式II所示的基团；所述卤素原子选自氯原子、溴原子或碘原子；
[0014][0015]所述基团A选自具有式III或式IV结构的基团；
[0016][0017][0018]所述N
‑
甲基
‑
N
‑
丁酸的羧基端接枝基团A得到的基团具有式V、式VI所述的结构；
[0019][0020]根据本申请的另一个方面，提供一种上述的荧光化合物的制备方法，包括以下步骤，
[0021]将含有底物1和底物2的原料与碱溶液混合，发生脱水缩合反应，得到所述荧光化合物；
[0022]所述底物1选自具有式VII、式VIII、或式IX结构的化合物；
[0023][0024]所述底物2选自具有式X的结构的化合物；
[0025][0026]所述碱溶液含有碱性物质和溶剂；
[0027]所述溶剂选自无水甲醇、无水乙醇、异丙醇、正丁醇中的一种；
[0028]所述碱性物质选自氢氧化钾、氢氧化钠、甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾中的一种；
[0029]所述脱水缩合的反应时间为12～48小时；
[0030]所述脱水缩合的反应温度为25～50℃。
[0031]所述方法还包括将所得到的荧光化合物进行改性；
[0032]所述改性包括：将含有荧光化合物和接枝剂的原料与催化剂、溶剂混合，经酸胺缩合反应，得到所述经过改性的荧光化合物。
[0033]所述接枝剂选自C3‑
20
‑
NH2中的一种；
[0034]所述催化剂选自1水合1
‑
羟基苯并三唑、三乙胺、1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐中的至少一种；
[0035]所述溶剂选自无水N，N
‑
二甲基甲酰胺、无水二甲基亚砜、无水四氢呋喃。
[0036]优选地，所述混合并进行酸胺缩合反应后，还要在室温下搅拌过夜，水猝灭，用二氯甲烷萃取3次，每次二氯甲烷的用量为50mL，然后真空干燥，使用甲醇/二氯甲烷＝1:20作为洗脱剂通过快速色谱法进一步纯化，获得所述经过改性的荧光化合物。
[0037]根据本申请的另一个方面，提供了一种荧光化合物作为荧光探针的应用，所述荧光探针含有上述的化合物或上述的化合物的制备方法制备的化合物以及n为1时，R2为二甲氨基时具有式I结构的化合物。
[0038]所述荧光探针用于检测蛋白质的错误折叠。
[0039]所述应用通过利用荧光探针检测蛋白质的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种荧光化合物，其特征在于，具有式I的结构：其中，R1选自酮基或二氰基；n选自0～10；R2选自C1～C5烷氧基、久洛尼定基团、氨基或取代的氨基中的一种；所述取代的氨基选自二甲氨基、N,N
‑
二(2
‑
羟乙基)、N
‑
甲基
‑
N
‑
丁酸中的一种；n为1时，R2不为二甲氨基。2.根据权利要求1所述的荧光化合物，其特征在于，所述取代的氨基为N
‑
甲基
‑
N
‑
丁酸时，N
‑
甲基
‑
N
‑
丁酸的羧基端接枝有基团A；所述基团A为C3‑
20
‑
NH
‑
；所述C3‑
20
中具有一个或两个醚键；所述C3‑
20
中含有烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、环炔基或苯环中的至少一种；C3‑
20
的至少一端为基团X；所述基团X选自卤素原子或式II所示的基团；所述卤素原子选自氯原子、溴原子或碘原子；3.根据权利要求2所述的荧光化合物，其特征在于，所述基团A选自具有式III或式IV结构的基团；所述N
‑
甲基
‑
N
‑
丁酸的羧基端接枝基团A得到的基团具有式V、式VI所述的结构；
4.一种权利要求1～3中任意一项所述的荧光化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，将含有底物1和底物2的原料与碱溶液混合，发生脱水缩合反应，得到所述荧光化合物；所述底物1选自具有式VII、式VIII、或式IX结构的化合物；所述底物2...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘宇，曾亮钢，金文翰，万旺，黄亚男，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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