一种ADC样品高DAR值的盐析方法技术

本发明专利技术公开了一种ADC样品高DAR值的盐析方法，盐析法应用步骤如下：S1：ADC样品制备，前期处理为靶向蛋白、毒性负载制备；S2：中性盐沉淀，采用中性盐沉淀DAR样品；S3：HIC检测抗体偶联率，采用高效液相色谱仪记录色谱图；S4：SEC检测纯度，采用高效液相色谱仪进行纯度检测；S5：结果分析，根据色谱分析DAR值，得出应用参数。本发明专利技术利用盐析方法对含有高DAR值ADC样品进行沉淀，通过对盐浓度的控制实现高DAR样品的去除，同时，沉淀中的高DAR值样品亦可以通过复溶降低盐浓度后复性，有效节约时间、人工、设备成本。备成本。备成本。

【技术实现步骤摘要】
一种ADC样品高DAR值的盐析方法


[0001]本专利技术涉及
，具体为一种ADC样品高DAR值的盐析方法。

技术介绍

[0002]抗体偶联药物(ADC)是由靶向特异性抗原的抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子链接而成，兼具传统小分子化疗的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性。ADC由三个主要部分组成：负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子。ADC的理化性质分析通常包括药物抗体偶联比(DAR)和药物分布、分子大小变异体等。药物抗体比(DAR)是连接到每个mAb的有效载荷部分的平均数量，可通过HIC、RP
‑
HPLC、HPLC
‑
MS等测试方法获得。
[0003]DAR对药物药理学和活性有影响，DAR值对ADC药物研发后期阶段是必不可少的。ADC药物在体内循环过程中被肿瘤细胞摄入数量有限，因此通常较高的DAR有利于提高效力。然而ADC药物中采用的小分子药物有着较强的疏水性，DAR值过高时会引起ADC药物聚集，导致在体内循环半衰期减少以及毒副作用提高，这就导致过高的DAR不可取。
[0004]常规操作可以通过层析纯化方法对ADC样品进行纯化从而去除高偶联荷载的ADC成分，如D6和D8。具体操作步骤与制备疏水相互作用色谱相类似。此过程需要配备高价值设备，如纯化分析仪器AKTA，需要较长的工艺摸索，同时需要对纯化后样品进行UFDF超滤换液体，整体成本非常高。另外，通过调整工艺来实现低DAR值样品会导致裸抗比例偏高，影响药物质量。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种ADC样品高DAR值的盐析方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种ADC样品高DAR值的盐析方法，盐析法应用步骤如下：
[0007]S1：ADC样品制备，前期处理为靶向蛋白、毒性负载制备；
[0008]S2：中性盐沉淀，采用中性盐沉淀DAR样品；
[0009]S3：HIC检测抗体偶联率，采用高效液相色谱仪记录色谱图；
[0010]S4：SEC检测纯度，采用高效液相色谱仪进行纯度检测；
[0011]S5：结果分析，根据色谱分析DAR值，得出应用参数。
[0012]优选的，基于盐析法应用步骤的S2中：中性盐为硫酸铵或氯化钠。
[0013]优选的，基于盐析法应用步骤的S1中：
[0014]ADC样品制备步骤如下：取两组10mg单抗置于5ml离心管，加入50mM PBS，pH7.4缓冲液稀释抗体浓度至5mg/ml，按照反应液总体积5％加入100mM EDTA水溶液，震荡混匀后加入2mg/ml的TCEP水溶液进行抗体还原，TCEP与抗体的摩尔比2.75∶1，震荡混匀后置于制冷型恒温混匀仪上反应，恒温条件为37℃，2h。
[0015]优选的，基于盐析法应用步骤的S1中：
[0016]按照药物与抗体终浓度摩尔比9∶1加入vc
‑
MMAE的DMA溶液，按照反应液总体积10％补充DMA，震荡混匀后置于制冷型恒温混匀仪上反应，恒温条件为4℃，1h，用超滤管置换样品保存buffer，分别计为ADC
‑
1、ADC
‑
2。
[0017]优选的，基于盐析法应用步骤的S2中：采用硫酸铵沉淀高DAR样品：
[0018]配制饱和硫酸铵溶液：室温条件下，每100mL 30mM His
‑
HAc pH5.5加入76.7g硫酸铵固体配成饱和硫酸铵溶液；
[0019]在ADC样品中逐步加入硫酸铵饱和溶液，发现在20％浓度时ADC明显沉淀，接下来，分别取4支ADC，为避免局部沉淀，缓慢、搅动加入饱和硫酸铵溶液，配制成含有饱和硫酸铵浓度分别为5％、10％、15％和20％的ADC溶液，涡旋振荡混匀，静置10min。
[0020]优选的，基于盐析法应用步骤的S2中：采用氯化钠沉淀高DAR样品：
[0021]配制饱和氯化钠溶液：室温条件下，每100mL 30mM His
‑
HAc pH5.5加入20.0g氯化钠固体配成饱和氯化钠溶液；
[0022]在ADC样品中逐步加入氯化钠饱和溶液，发现在50％浓度时ADC明显沉淀。接下来，分别取6支ADC，为避免局部沉淀，缓慢、搅动加入饱和氯化钠溶液，配制成含有饱和氯化钠浓度分别为5％、10％、20％、30％、40％、50％的ADC溶液，涡旋振荡混匀，静置10min。
[0023]优选的，基于盐析法应用步骤的S2中：
[0024]硫酸铵样本与氯化钠样本均通过离心机14000rcf，离心5min，取上清，用0.5mL脱盐柱处理样品，去除氯化钠，样品回收进行检测；离心后沉淀用30mM His
‑
HAc pH5.5复溶，样品回收进行检测。
[0025]优选的，基于盐析法应用步骤的S3中：HIC检测抗体偶联率，采用高效液相色谱仪记录色谱图，色谱柱规格为MabPac
TM HIC
‑
Butyl 5μm 4.6
×
100mm；
[0026]流动相记为：流动相A(MPA)：1.5M(NH4)2S04+50mM磷酸钾盐(pH7.0)；流动相B(MPB)：50mM磷酸钠盐(pH 7.0)/异丙醇(75：25V/V)。
[0027]优选的，基于盐析法应用步骤的S3中：
[0028]洗脱过程如下：0
‑
2min流动相A体积为100％
‑
95％，流动相B体积为0％
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5％；2
‑
22min流动相A体积为95％
‑
5％，流动相B体积为5％
‑
95％；22
‑
24min流动相A体积为5％
‑
0％，流动相B体积为95％
‑
100％；24
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26min流动相A体积为0％
‑
100％，流动相B体积为100％
‑
0％；26
‑
30min流动相A体积为100％
‑
100％，流动相B体积为0％
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0％；
[0029]检测条件：设置流动相流速为1ml/min，检测波长为280nm，柱温30℃。
[0030]优选的，基于盐析法应用步骤的S4中：SEC检测纯度采用高效液相色谱仪选用规格为1260安捷伦液相色谱仪，色谱柱规格为Waters Xbridge BEH200SEC 7.8
×
300mm，3.5μm；
[0031]流动相：50mM PB+200mM Arg(pH 6.80)+10％IPA，按照S3中的洗脱程序进行洗脱，0
‑
30min流动相A体积为100％
‑
100％，取偶联后样品20μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种ADC样品高DAR值的盐析方法，其特征在于：盐析法应用步骤如下：S1：ADC样品制备，前期处理为靶向蛋白、毒性负载制备；S2：中性盐沉淀，采用中性盐沉淀DAR样品；S3：HIC检测抗体偶联率，采用高效液相色谱仪记录色谱图；S4：SEC检测纯度，采用高效液相色谱仪进行纯度检测；S5：结果分析，根据色谱分析DAR值，得出应用参数。2.根据权利要求1所述的一种ADC样品高DAR值的盐析方法，其特征在于：基于盐析法应用步骤的S2中：中性盐为硫酸铵或氯化钠。3.根据权利要求1所述的一种ADC样品高DAR值的盐析方法，其特征在于：基于盐析法应用步骤的S1中：ADC样品制备步骤如下：取两组10mg单抗置于5ml离心管，加入50mM PBS，pH7.4缓冲液稀释抗体浓度至5mg/ml，按照反应液总体积5％加入100mM EDTA水溶液，震荡混匀后加入2mg/ml的TCEP水溶液进行抗体还原，TCEP与抗体的摩尔比2.75∶1，震荡混匀后置于制冷型恒温混匀仪上反应，恒温条件为37℃，2h。4.根据权利要求1所述的一种ADC样品高DAR值的盐析方法，其特征在于：基于盐析法应用步骤的S1中：按照药物与抗体终浓度摩尔比9∶1加入vc
‑
MMAE的DMA溶液，按照反应液总体积10％补充DMA，震荡混匀后置于制冷型恒温混匀仪上反应，恒温条件为4℃，1h，用超滤管置换样品保存buffer，分别计为ADC
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1、ADC
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2。5.根据权利要求1所述的一种ADC样品高DAR值的盐析方法，其特征在于：基于盐析法应用步骤的S2中：采用硫酸铵沉淀高DAR样品：配制饱和硫酸铵溶液：室温条件下，每100mL 30mM His
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HAc pH5.5加入76.7g硫酸铵固体配成饱和硫酸铵溶液；在ADC样品中逐步加入硫酸铵饱和溶液，发现在20％浓度时ADC明显沉淀，接下来，分别取4支ADC，为避免局部沉淀，缓慢、搅动加入饱和硫酸铵溶液，配制成含有饱和硫酸铵浓度分别为5％、10％、15％和20％的ADC溶液，涡旋振荡混匀，静置10min。6.根据权利要求1所述的一种ADC样品高DAR值的盐析方法，其特征在于：基于盐析法应用步骤的S2中：采用氯化钠沉淀高DAR样品：配制饱和氯化钠溶液：室温条件下，每100mL 30mM His
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HAc pH5.5加入20.0g氯化钠固体配成饱和氯化钠溶液；在ADC样品中逐步加入氯化钠饱和溶液，发现在50％浓度时ADC明显沉淀。接下来，分别取6支ADC，为避免局部沉淀，缓慢、搅动加入饱和氯化钠溶液，配制成含有饱和氯化钠浓度分别为5％、10％、20％、30％、40％、50％的ADC溶液，涡旋振荡混匀，静置10min。7.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李楠，张绪，陈建新，刘素霞，
申请(专利权)人：上海臻皓生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：