CRISPR酶以及系统技术方案

本发明专利技术属于核酸编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)技术领域。具体而言，本发明专利技术涉及CRISPR酶以及系统，涉及一种扩大PAM识别范围的Cas蛋白及其应用，具有广泛的应用前景。应用前景。应用前景。

【技术实现步骤摘要】
CRISPR酶以及系统


[0001]本专利技术涉及基因编辑领域，特别是规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)
具体而言，本专利技术涉及CRISPR酶以及系统，具体涉及一种扩大PAM识别范围的Cas蛋白、相应的CRISPR系统及应用。

技术介绍

[0002]CRISPR/Cas技术是一种被广泛使用的基因编辑技术，它通过RNA引导对基因组上的靶序列进行特异性结合并切割DNA产生双链断裂，利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。
[0003]CRISPR/Cas9系统是最常用的II型CRISPR系统，它识别3
’‑
NGG的PAM基序，对靶标序列进行平末端切割。CRISPR/Cas Type V系统是一类新发现的CRISPR系统，它具有5
’‑
TTN的基序，对靶标序列进行粘性末端切割，例如Cpf1,C2c1,CasX,CasY。然而目前存在的不同的CRISPR/Cas各有不同的优点和缺陷。例如Cas9,C2c1和CasX均需要两条RNA进行指导RNA，而Cpf1只需要一条指导RNA而且可以用来进行多重基因编辑。CasX具有980个氨基酸的大小，而常见的Cas9，C2c1，CasY和Cpf1通常大小在1300个氨基酸左右。此外，Cas9，Cpf1，CasX，CasY的PAM序列都比较复杂多样，而C2c1识别严谨的5
’‑
TTN，因此它的靶标位点比其他系统容易被预测从而降低了潜在的脱靶效应。
[0004]中国专利技术专利CN114672473A中公开了一种氨基酸产生突变的Cas蛋白，还公开了该蛋白可以在真核细胞中进行基因编辑，但是，其识别的PAM位点为TTN，本申请经过实验验证，拓宽了该蛋白对于PAM的识别范围，提高了在真核细胞中的编辑范围，扩展了其应用范围。

技术实现思路

[0005]本申请的专利技术人经过大量实验和反复摸索，提供了一种PAM识别范围更大的CRISPR/CAS系统，扩展了靶点的选择范围，增加了其应用范围，有良好的应用前景。
[0006]一方面，本专利技术提供了一种工程化的、非天然存在的CRISPR系统，包含
[0007]a)Cas蛋白，所述Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，以及
[0008]b)至少一种被设计与所述Cas蛋白形成复合物的gRNA，其中所述gRNA包含与靶序列杂交的区域，其中所述靶序列位于原型间隔区相邻基序(PAM)的3
’
端，且所述PAM序列为ATN，其中N选自A、T、C或G中的任意一种。
[0009]一方面，本专利技术提供了一种工程化、非天然存在的CRISPR系统，包含
[0010]a)一种或多种编码上述Cas蛋白的核苷酸序列，以及
[0011]b)一种或多种编码至少一种gRNA的核苷酸序列，所述至少一种gRNA与所述Cas蛋白形成复合物，其中所述gRNA与靶核酸杂交，其中所述靶序列位于原型间隔区相邻基序(PAM)的3
’
端，且所述PAM序列为ATN，其中N选自A、T、C或G中的任意一种。
[0012]上述系统中，所述Cas蛋白的生物学功能包括但不限于，与指导RNA结合的活性、核
酸内切酶活性、在指导RNA引导下与靶序列特定位点结合并切割的活性，包括但不限于Cis切割活性和Trans切割活性。
[0013]本专利技术中，“Cas突变蛋白”也可以称之为突变的Cas蛋白，或者Cas蛋白变体。
[0014]本专利技术中，所述gRNA包括第一区段和第二区段；所述第一区段称为“骨架区”、“蛋白质结合区段”、“蛋白质结合序列”、或者“同向重复(Direct Repeat)序列”；所述第二区段又称为“靶向核酸的靶向序列”或者“靶向核酸的靶向区段”，或者“靶向靶序列的引导序列”。
[0015]所述gRNA的第一区段能够与本专利技术的Cas蛋白相互作用，从而使Cas蛋白和gRNA形成复合物。
[0016]在优选的实施方式中，所述第一区段为如上所述的同向重复序列。
[0017]本专利技术靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段包含与靶核酸中的靶序列互补的核苷酸序列。换言之，本专利技术靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段经过杂交(即，碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用。其中，所述靶序列位于原型间隔区相邻基序(PAM)的3
’
端；前述PAM序列为5
’‑
ATN
‑3’
，其中，N＝C/G/A/T。
[0018]因此，靶向核酸的靶向序列或靶向核酸的靶向区段可改变，或可被修饰以杂交靶核酸内的任何希望的序列。所述核酸选自DNA或RNA。
[0019]在一种实施方式中，所述编码所述Cas蛋白的核酸序列和编码一种或多种指导RNA的核酸是人工合成的。
[0020]在一种实施方式中，所述编码所述Cas蛋白的核酸序列和编码一种或多种指导RNA的核酸并不共同天然存在。
[0021]在一个实施方式中，所述的核苷酸序列经过密码子优化用于在原核细胞中进行表达。
[0022]在一个实施方式中，所述的核苷酸序列经过密码子优化用于在真核细胞中进行表达。
[0023]一方面，本专利技术还提供了一种包含一种或多种载体的工程化的、非天然存在的载体系统，其中包含
[0024]a)可操作地连接一种或多种编码上述Cas蛋白的核苷酸序列的第一调控元件；
[0025]b)可操作地连接一种或多种编码至少一种gRNA的核苷酸序列的第二调控元件，所述至少一种gRNA与所述Cas蛋白形成复合物，其中所述gRNA与靶序列杂交，其中所述靶序列位于原型间隔区相邻基序(PAM)的3
’
端且所述PAM序列为ATN，其中N选自A、T、C或G中的任意一种；
[0026]组分(a)和(b)位于所述系统的相同或者不同的载体上。
[0027]所述第一和第二调控元件包括启动子(例如，组成型启动子或诱导型启动子)、增强子(例如35S promoter或35S enhanced promoter)、内部核糖体进入位点(IRES)、和其他表达控制元件(例如转录终止信号，如多聚腺苷酸化信号和多聚U序列)。
[0028]在一些实施方案中，所述系统中的载体是病毒载体(例如逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关载体和单纯疱疹载体)，还可以是质粒、病毒、粘粒、噬菌体等类型，它们是本领域技术人员所熟知的。
[0029]在一些实施例中，本文提供的系统处于递送系统中。在一些实施方案中，递送系统
是纳米颗粒，脂质体，外体，微泡和基因枪。
[0030]在一个实施方式中，所述靶序列是来自原核细胞或真核细胞的DNA或RNA序列。在一个实施方式中，所述靶序列是非天然存在的DNA或RNA序列。
[0031]在一个实施方式中，所述靶序列存在于细胞内。在一个实施方式中，所述靶序列存在于细胞核内或细胞质(例如，细胞器)内。在一个实施方式中，所述细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程化的、非天然存在的CRISPR系统，包含a)Cas蛋白，所述Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，以及b)至少一种被设计为与所述Cas蛋白形成复合物的gRNA，其中所述gRNA包含与靶序列杂交的区域，其中所述靶序列位于原型间隔区相邻基序(PAM)的3
’
端，且所述PAM序列为ATN，其中N选自A、T、C或G中的任意一种。2.一种工程化的、非天然存在的CRISPR系统，包含a)一种或多种编码权利要求1中的Cas蛋白的核苷酸序列，以及b)一种或多种编码至少一种gRNA的核苷酸序列，所述至少一种gRNA与所述Cas蛋白形成复合物，其中所述gRNA与靶序列杂交，其中所述靶序列位于原型间隔区相邻基序(PAM)的3
’
端，且所述PAM序列为ATN,其中N选自A、T、C或G中的任意一种。3.一种包含一种或多种载体的工程化的、非天然存在的载体系统，包含a)可操作地连接至一种或多种编码权利要求1中的Cas蛋白的核苷酸序列的第一调控元件；b)可操作地连接至一种或多种编码至少一种gRNA的核苷酸序列的第二调控元件，所述至少一种gRNA与所述Cas蛋白形成复合物，其中所述gRNA与靶序列杂交，其中所述靶序列位于原型间隔区相邻基序(PAM)的3
’
端且所述PAM序列为ATN，其中N选自A、T、C或G中的任意一种；组分(a)和(b)位于所述系统的相同或不同的载体上。4.一种工程化的、非天然存在的CRISPR系统，包含a)Cas蛋白，所述Cas蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；或一种或多种编码所述Cas蛋白核苷酸序列，以及b)至少一种与所述Cas蛋白形成复合物的gRNA，其中所述gRNA与靶序列杂交，或一种或多种编码所述至少一种gRNA的核苷酸序列，其中所述靶序列位于原型间隔区相邻基序(PAM)的3
’
端，且所述PAM序列为ATN，其中N选自A、T、C或G中的任意一种。5.根据权利要求1
‑
4任一所述的系统，其中所述Cas蛋白还连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：段志强，
申请(专利权)人：山东舜丰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：