一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种通用型禽白血病病毒新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述试剂盒包括反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、SYBR Green I、检测引物，所述检测引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。与传统检测试剂盒和检测方法相比，本发明专利技术方法具有简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，在检测时间与检测成本方面具有显著优势，适合于批量检测。适合于批量检测。适合于批量检测。

【技术实现步骤摘要】
一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一种通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。

技术介绍

[0002]禽白血病病毒(Avian leukosis virus，ALV)属于反转录病毒科α反转录病毒属成员，感染禽类能够引起多种肿瘤性疾病。根据病毒囊膜蛋白抗原性差异、病毒干扰实验及宿主范围，目前ALV可分为A～K 11个亚群(ALV
‑
A～K)。仅A～E、J、K亚群从鸡分离到，其余亚群见于其他鸟类，其中A亚群对蛋鸡危害较大，J亚群对肉鸡危害严重。由于该病具有水平传播与垂直传播的能力，因而给养禽业造成了严重的危害，属于“国家中长期动物疫病防治规划”中必须净化的疫病。
[0003]我国对于禽白血病的通用检测标准是基于P27抗原的酶联免疫吸附试验(NY
‑
T 680
‑
2018禽白血病病毒p27抗原酶联免疫吸附试验方法)，该方法在检测成本、灵敏度、特异性方面存在诸多缺陷。随着科技的发展，以PCR、LAMP等分子生物学方法在禽白血病病毒的快速检测中得到逐步应用，但上述方法仍存在诸多缺陷。例如，PCR方法灵敏度相对偏低，检测时间也相对偏长；LAMP方法较PCR方法灵敏度大幅提高，检测时间也缩短，但极易发生气溶胶污染，且因引物较多易造成引物二聚体，无法通过琼脂糖凝胶电泳辨别假阳性结果。
[0004]基于上述原因，本专利技术提供一种新型的禽白血病病毒核酸检测方法，可有效解决普通PCR和LAMP检测中的缺陷仅使用一对引物，就可以达到简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

技术实现思路

[0005]本专利技术针对传统核酸检测技术在禽白血病病毒检测中存在的不足，特别是如何提高检测效率、灵敏度与特异性，提供了一种特异性检测禽白血病病毒的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。
[0006]本专利技术技术方案如下：
[0007]本专利技术提供了一种特异性检测禽白血病病毒的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述禽白血病病毒的核酸检测试剂盒包括10
×
反应缓冲液、8000U/μl Bst DNA聚合酶、10mM dNTPs、检测引物、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、阳性对照和阴性对照；所述检测引物为SEQ ID NO.1的引物和SEQ ID NO.2的引物的组合。
[0008]本专利技术通过使用特别设计的一对检测引物，就可以实现特异性强、灵敏度高的优点。特别需要说明的是，本专利技术的试剂盒加入石墨化碳纳米管后的扩增条带，有单一的目的特异性条带(如图1所示)。本专利技术设计是在链交换扩增(使用一对引物进行等温扩增)的基础上改进的(仍使用一对引物，分两步进行扩增)。研究发现，在不加入石墨化碳纳米管的情况下，会出现类似链交换扩增的非特异性扩增现象(如图1所示，出现引物二聚体而特异性条带不清晰等)，所以通过加入石墨化碳纳米管等新型纳米材料可以最大限度的提高反应
特异性。石墨化碳纳米管对基因扩增的机制不明，据推测由于表面电荷性质，可与单链DNA形成相对稳定的结构，而双链DNA由于双链间氢健作用力更稳定，所以不会石墨化碳纳米管结合。因此，石墨化碳纳米管可以吸附多余未参加反应的引物单链，以防止引物二聚体的产生，有效提高反应特异性。
[0009]本专利技术的试剂盒中加入甜菜碱可帮助DNA聚合酶顺利通过DNA某些复杂二级结构，防止DNA聚合酶从模板DNA中解离。DNA局部区域因含有多个复杂碱基(Py
‑
G
‑
C)，会促使DNA聚合酶的停滞，最终导致DNA聚合酶停止有效延伸。而甜菜碱可提高DNA小沟中富含鸟嘌呤和胞嘧啶区域的鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响DNA分子结构，改变DNA灵活性，帮助DNA聚合酶沿着DNA模板延伸。其次，甜菜碱可消除变性温度对碱基的依赖性。浓度依赖性降低高GC含量序列的Tm，并使不同引物的Tm相接近，最终降低DNATm值。此外，甜菜碱溶液可稳定DNA
‑
蛋白复合物。
[0010]进一步的，所述阳性对照为禽白血病病毒JS11C1阳性模板，所述阴性对照为无菌生理盐水
[0011]进一步的，所述试剂盒检测体系的组分为：每20μL反应体系包括：2μL的10
×
扩增缓冲液、2μL dNTPs(1～10mM)、0.5μL聚乙二醇甲醚、1μL甜菜碱(8mM)、引物ALV
‑
F和ALV
‑
R(10μM)各2μL、0.8μLBst DNA聚合酶(8000U/mL)、1μL石墨化碳纳米管溶液(10ng/μL)、0.2μL SYBR Green I(100
×
)、3μL模板和5μL无菌生理盐水。
[0012]进一步的，所述禽白血病病毒检测方法的反应流程为：74℃1秒，61℃1秒，循环总数45。
[0013]进一步的，所述10
×
反应缓冲液含有200mM Tris
‑
HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％曲拉通，pH 8.0～8.8。
[0014]进一步的，所述禽白血病病毒检测方法的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0015]进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。
[0016]更进一步的，一种使用通用型禽白血病病毒检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：
[0017]S1：试剂盒提取样品中的DNA，得到检测模板。
[0018]S2：将缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、SYBR Green I、甜菜碱、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液、检测引物以及DNA模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积20μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量PCR仪进行扩增反应；
[0019]S3：当反应结束后，荧光曲线起峰(荧光值大于0.001)判定为阳性；当荧光曲线未起峰(荧光值小于等于0.001)时判定为阴性。或采用3％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。
[0020]相比于现有技术，本专利技术的有益效果为：
[0021]本专利技术根据美国生物技术信息中心基因序列数据库GenBank中已公开的已知不同亚型禽白血病病毒全基因序列，通过多种比较基因组学技术比较分析，成功筛选获得禽白血病病毒的特异基因序列，进一步设计引物，优化反应条件，成功建立通用型禽白血病病毒核酸检测方法，具有灵敏度高，特异性强的优点。同时，本专利技术只需通过一次反应，即可对禽白血病病毒进行快速检测，相比传统的核酸检测方法，在检测时间与检测成本方面具有较
大优势，适合于批量检测。
附图说明
[0022]图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中：M为Takara 20bp DNA Ladder(Dye Plus)，泳道1为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通用型禽白血病病毒新型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：1)反应缓冲液；2)检测引物：正向引物ALV
‑
F和反向引物ALV
‑
R，所述的ALV
‑
F和ALV
‑
R引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；3)DNA聚合酶；4)dNTPs；5)SYBR Green I；6)甜菜碱；7)聚乙二醇甲醚；8)石墨化碳纳米管。2.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌新型核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：9)阳性对照：禽白血病病毒JS11C1阳性模板；10)阴性对照：无菌生理盐水。3.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液含有Tris
‑
HCl、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁和曲拉通。4.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于：正向引物ALV
‑
F和反向引物ALV
‑
R的浓度均为10pmol/μL。5.根据权利要求1所述的通用型禽白血病病毒核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测反应体系为：每20μL反应体系包括：2μL的10
×
...

【专利技术属性】
技术研发人员：龚建森，王鑫，盛中伟，张笛，张萍，沈海玉，董永毅，开妍，徐步，窦新红，
申请(专利权)人：江苏省家禽科学研究所，
类型：发明
国别省市：