一种类弹性蛋白多肽(VPTGIG)制造技术

本发明专利技术公开了一种类弹性蛋白多肽(VPTGIG)

【技术实现步骤摘要】
一种类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]具有生物相容性和自组装特性的新型纳米材料的发现和应用拓宽了纳米材料在生物医学领域研究中的发展。该领域的进展有望推进生物医学研究，并为设计具有自组装能力的智能纳米生物相容性材料提供新的灵感。这些新设计的材料具有生物相容性高、稳定性好、药代动力学优异等特性。在这些新型纳米材料中，类弹性蛋白多肽(elastin
‑
like polypeptides，ELPs)及其衍生物等生物相容性材料显示出巨大的潜力。弹性蛋白是一种重要的细胞外基质蛋白，主要存在于动脉、皮肤、肺和韧带的结缔组织中，在体内可与微原纤维结合形成弹性纤维，与胶原纤维一起赋予组织以弹性和抗张能力。ELPs是由原弹性蛋白疏水结构域中的重复氨基酸序列衍生而来的重复人工多肽，其结构主要由五肽(Val
‑
Pro
‑
Gly
‑
Xaa
‑
Gly,VPGXG)重复单元串联而成，其中Xaa代表除脯氨酸以外的任何一种氨基酸。ELPs最典型的特性是温度敏感性和自组装性，随着环境温度的改变，ELPs会发生可逆相变过程。在一定环境条件下，若环境温度低于相变温度(transition temperature,Tt)则ELPs高度可溶，反之高于该温度时则组装形成凝聚相，随着温度降低，又恢复溶液态。这种相变或自组装过程主要是温度感应的聚集，通常具有不同程度的热滞。凭借这些特殊性质，纳米工程ELPs被认为是一种新的有前景的药物递送和控释材料，具有延长药物半衰期、较低的药物毒性、较高的药物溶解性、良好的生物相容性、优异的药代动力学行为等特点。然而，它们可能的应用领域主要取决于它们的内在特性，由于其单一的高Tt值、不受控制的自组装行为和不可调节的滞后特性，它们在生物医学领域的进一步应用仍然受到很大限制。
[0003]ELPs具有重要的理论研究和实际应用价值，但也存在一些问题，主要有：(1)蛋白纯化复杂，需要经过离子交换、分子排阻等一系列层析方法纯化，成本高昂；(2)ELPs相变蛋白序列较为有限，生物医学应用相对受限。

技术实现思路

[0004]为了解决上述
技术介绍
中存在的问题，本专利技术提供一种类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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及其制备方法和应用。
[0005]本专利技术提供的技术方案如下：
[0006]一种类弹性蛋白多肽，类弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(VPTGIG)
n
，n＝5
‑
50。
[0007]基于上述技术方案，进一步地，类弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(VPTGIG)
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，在0.5mg/ml浓度下的Tt值为37℃，并保持可逆相变特性。
[0008]本专利技术另一方面提供上述的类弹性蛋白多肽的制备方法，主要包括以下步骤：
[0009](1)人工合成编码所述的类弹性蛋白多肽的基因序列，插入质粒中构建重组质粒，并导入到DH5a大肠杆菌中，培养后提取重组质粒；
[0010](2)将步骤(1)得到的重组质粒转染到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达；
[0011](3)对步骤(2)得到的大肠杆菌进行破碎处理，得到含有目的蛋白的可溶性蛋白溶液；
[0012](4)通过可逆相变循环法纯化获得类弹性蛋白多肽。
[0013]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中所述质粒为pET28a，基因片段插入到pET28a载体的NcoI和XhoI之间。
[0014]基于上述技术方案，进一步地，步骤(1)中编码所述的类弹性蛋白多肽的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0015]基于上述技术方案，进一步地，步骤(2)中诱导表达的具体过程为：当菌液的OD
600
值达到0.6
‑
0.8时，加入0.5～5mmol/L的IPTG，30～37℃摇菌表达3～8h。
[0016]基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中破碎处理的具体方式为超声破碎、均质破碎、球磨破碎、反复冻融破碎和溶菌酶酶解破碎中的一种或二种以上的组合。
[0017]基于上述技术方案，进一步地，步骤(3)中得到含有目的蛋白的可溶性蛋白溶液的具体过程为：将破碎处理得到的大肠杆菌破碎液于1～4℃下10000～15000rpm离心5～20min，弃沉淀，将上清移入新的离心管中，重复上述步骤直至离心无肉眼可见的沉淀物，保留上清液，即为含有目的蛋白的可溶性蛋白溶液。
[0018]基于上述技术方案，进一步地，步骤(4)中可逆相变循环法包括以下步骤：
[0019]1)将含有目的蛋白的可溶性蛋白溶液中加入NaCl固体至终浓度为1～3mol/L，38～45℃水浴10～30min，30～36℃条件下8000～12000rpm离心5～20min，弃上清；
[0020]2)使用0.01～0.1mol/L PBS缓冲液重悬步骤1)得到的沉淀，冰置5～30min，于1～4℃条件下8000～12000离心5～20min，弃沉淀，并将上清移入新的离心管中。
[0021]基于上述技术方案，进一步地，所述的可逆相变循环法循环2次以上。
[0022]本专利技术还提供上述的类弹性蛋白多肽在制备药物递送系统方面的应用。
[0023]本专利技术相对于现有技术具有的有益效果如下：
[0024]1.本专利技术的类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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纯化方法简单，同时降低了制备成本，能够实现大规模分离纯化类弹性蛋白；
[0025]2.本专利技术的的类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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丰富了ELPs种类，为药物载体提供新类型；
[0026]3.本专利技术探究了1,6己二醇对类弹性蛋白多肽ELP25自组装机制的影响，有助于进一步了解之前报道的其他缺乏分子深度理解的ELPs的行为，有助于设计满足不同需求的新ELPs，并扩大其在多个领域的实际应用范围。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。
[0028]图1为类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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的酶切验证图。
[0029]图2为类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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的ITC纯化结果图。
[0030]图3为类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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热行为分析图。
[0031]图4为类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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圆二色谱分析图。
[0032]图5为不同浓度的1,6己二醇对类弹性蛋白多肽(VPTGIG)
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的浊度影响图。
具体实施方式
[0033]下面结合实施例对本专利技术进行详细的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种类弹性蛋白多肽，其特征在于，所述的类弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(VPTGIG)
n
，n＝5
‑
50。2.根据权利要求1所述的类弹性蛋白多肽，其特征在于，类弹性蛋白多肽的氨基酸序列为(VPTGIG)
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。3.权利要求1或2所述的类弹性蛋白多肽的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：(1)合成编码所述的类弹性蛋白多肽的基因序列，插入质粒中构建重组质粒，并导入到DH5a大肠杆菌中，培养后提取重组质粒；(2)将步骤(1)得到的重组质粒转染到大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达；(3)对步骤(2)得到的大肠杆菌进行破碎处理，得到含有目的蛋白的可溶性蛋白溶液；(4)通过可逆相变循环法纯化获得类弹性蛋白多肽。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述质粒为pET28a，基因片段插入到pET28a载体的NcoI和XhoI之间。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中诱导表达的具体过程为：当菌液的OD
600
值达到0.6
‑
0.8时，加入0.5～5mmol/L的IPTG，30～37℃摇菌表达3～8h。6.根据权利要求3所述的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨君，杨国新，陈思哲，屈明博，刘田，刘霖，杨青，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：