抗菌肽HLFP-5及其应用制造技术

本发明专利技术公开了抗菌肽HLFP

【技术实现步骤摘要】
抗菌肽HLFP
‑
5及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体地说，涉及一种新型的抗菌肽HLFP
‑
5及其应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着我国医疗技术的发展和医药卫生条件的改善，各种传染性疾病在一定程度上均得到有效控制。然而抗生素的频繁使用进一步加剧了细菌耐药性发展的进程。寻找一种合适的抗生素替代物变的更为迫切。抗菌肽由于其具备独特的膜破坏机制，使细菌产生耐药性的几率大大降低，因此抗菌肽成为抗生素的理想替代物之一。然而抗菌肽在临床上的应用常受到稳定性差的制约。
[0003]具体而言，抗菌肽发挥抗菌活性主要依靠其所包含的正电荷氨基酸与菌膜之间的负电荷成分发挥静电作用，但体内环境中存在的盐离子通常会影响抗菌肽和菌膜之间的静电作用，从而拮抗抗菌肽的抗菌活性。此外，体内存在的蛋白酶也会影响抗菌肽的抗菌效果。例如胰蛋白酶会特异性识别并切割序列中的正电荷氨基酸，如赖氨酸、精氨酸。糜蛋白酶会特异性识别并切割序列中的疏水性氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸等。目前公认的提高抗菌肽蛋白酶稳定性的方法包括在分子内形成二硫键以设计环肽、D型氨基酸取代、脂质修饰等。然而，这些策略都涉及化学修饰方法，导致肽链必须使用化学合成的方式获得，无法使用细菌融合表达系统获得，大大增加了抗菌肽的合成成本。因此，需借助于天然氨基酸的合理排列以最大限度地保证肽的盐离子稳定性和蛋白酶稳定性。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种新型的抗菌肽HLFP
‑<br/>5及其应用。
[0005]本专利技术基于对抗菌肽结构与功能关系和杀菌机制的理解，设计一种抗菌肽以解决稳定性不足的弊端。主要包括以下设计原则：1)选择芳香族氨基酸(苯丙氨酸)作为肽链的疏水核心，使肽能够深入而牢固地插入细菌膜中，有利于诱导膜扰动并最大限度的确保肽具备强的盐稳定性。2)将脯氨酸(Pro)置于苯丙氨酸的C端以防止胰凝乳蛋白酶裂解。3)在芳香族氨基酸的N末端放置一个脂肪族疏水性氨基酸(亮氨酸)，以进一步增加肽链的疏水性和极性面的深度。4)将组氨酸(His)置于亮氨酸的N端，以防止胃蛋白酶对芳香族氨基酸苯丙氨酸的切割。5)将由HLFP构成的疏水核心重复五次，满足抗菌所需疏水性的基本要求。6)赖氨酸(Lys)作为阳离子氨基酸位于序列的两端，为序列提供正电荷，为肽与细菌的相互作用提供必要的驱动力。同时，在每个Lys的C末端放置一个Pro，以防止被胰蛋白酶切割。在这里没有采用精氨酸作为阳离子氨基酸，因为即使在Pro的保护下，赖氨酸的蛋白酶稳定性依然强于精氨酸。序列中一共加入6个赖氨酸，以满足基本的正电荷要求，确保肽能够与菌膜充分发生。7)肽的C末端被胺化以进一步增强抗菌活性并提高稳定性。
[0006]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种抗菌肽HLFP
‑
5，氨基酸序列如下：KPKPKPHLFPHLFPHLFPHLFPHLFPKPKPKP
‑
NH2(SEQ ID NO:1)。
[0007]第二方面，本专利技术提供所述抗菌肽HLFP
‑
5的以下任一应用：
[0008]1)用于制备广谱抗菌剂；
[0009]2)用于制备防腐剂；
[0010]3)用于制备抗菌药物或组合物。
[0011]所述菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。
[0012]优选地，所述菌选自大肠杆菌(Escherichia coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)等。
[0013]第三方面，本专利技术提供一种广谱抗菌剂，活性成分为抗菌肽HLFP
‑
5。所述抗菌剂耐胃肠道环境，耐高盐，耐蛋白酶裂解。可以实现在酶和盐离子存在下对细菌的杀灭作用。
[0014]本专利技术提供的抗菌肽HLFP
‑
5，具备广谱抗菌活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阴性菌和阳性菌都具备抗菌效果，并且在模拟体内盐环境存在的条件下保留了抗菌活性，也能够抵抗高浓度蛋白酶的裂解，具有非常好的应用前景。
附图说明
[0015]图1为本专利技术较佳实施例中抗菌肽HLFP
‑
5的质谱图。
[0016]图2为本专利技术较佳实施例中抗菌肽HLFP
‑
5的液相色谱图。
具体实施方式
[0017]以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0018]实施例1固相化学合成法合成抗菌肽HLFP
‑5[0019]抗菌肽HLFP
‑
5的氨基酸序列为：KPKPKPHLFPHLFPHLFPHLFPHLFPKPKPKP
‑
NH2。合成方法如下：
[0020]1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc
‑
X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X
‑
Wang树脂；再将Fmoc
‑
Y
‑
Trt
‑
OH(9
‑
芴甲氧羧基
‑
三甲基
‑
Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。
[0021]2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，
‑
20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成。
[0022]3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干。
[0023]4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，质谱图中显示的分子量(图1)与理论分子量基本一致，另外，HLFP
‑
5的反向高效液相色谱显示其纯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗菌肽HLFP
‑
5，其特征在于，氨基酸序列如下：KPKPKPHLFPHLFPHLFPHLFPHLFPKPKPKP
‑
NH2。2.权利要求1所述抗菌肽HLFP
‑
5的以下任一应用：1)用于制备广谱抗菌剂；2)用于制备防腐剂。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌包括革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌。4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述菌选...

【专利技术属性】
技术研发人员：马曦，谭鹏，唐琪，王涛，丁亚坤，白跃宇，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：